李玉娟 王殿柱

1.内蒙古包头轻工职业技术学院农牧园林工程学院；2.内蒙古包头稀土高新区兽医站

一、实验材料

1.试验动物

包头市昆区、青山、九原、石拐等地的各个大型养殖场、养殖基地及散养户患子宫内膜炎奶牛。

2.试验药品及试剂

本试验所用试剂：Barid-parker （B-P） 琼脂培养基、Mueller-Hinton（M-H）肉汤、血平板培养基均为青岛海博生物技术有限公司生产；革兰染色液为广东环凯生物技术有限公司生产； 细菌基因组DNA 提取试剂盒为北京天根生物技术有限公司生产。

二、试验方法

1.样品采集

本试验对120 头被临床兽医诊断为临床型子宫内膜炎的奶牛做直肠检查，并采用直肠把握法采集子宫分泌物，并将其编号，封盖，贴上标签，置冰箱（-20℃）保存待检。

2.葡萄球菌的分离及鉴定

（1）奶牛子宫内膜炎葡萄球菌分离。 将采集到的子宫分泌物按常规方法进行前增菌；挑取前增菌菌液进行划线接种；将疑似葡萄球菌进行纯培养。

（2）葡萄球菌初步鉴定。 葡萄球菌初步鉴定主要是革兰染色镜检。 具体方法参照薛秀恒（2012）。

（3）葡萄球菌的分子生物学鉴定。采用PCR 方法对分离到的葡萄球菌进行分子生物学鉴定。 根据Ghebremedhin（2008）等报道的引物序列，合成gap 基因的引物，引物信息与反应条件见表1。

表1 葡萄球菌分子生物学鉴定PCR 反应引物信息

三、试验结果

1. 包头不同辖区奶牛子宫内膜炎葡萄球菌分离结果

本试验从包头不同辖区（昆区、青山区、九原区及石拐区）的奶牛养殖场、养殖基地及散养户中共选取了120 头患子宫内膜炎的奶牛， 并采集其子宫分泌物，共分离到葡萄球菌50 株（41.7%）。 结果显示，昆区、青山区、九原区及石拐区患子宫内膜炎分泌物中的葡萄球菌分离率分别为43.3%（13∕30）；36.7%（11∕30）；40%（12∕30）；46.7%（14∕30）。包头市不同辖区奶牛子宫内膜炎葡萄球菌分离情况见图1。

2.葡萄球菌分离鉴定结果

（1）葡萄球菌初步鉴定结果。 本试验分离到的葡萄球菌在巴尔德帕克琼脂平板上的菌落形态见图2；革兰染色镜检结果见图3。

（2）葡萄球菌分子生物学鉴定结果。采用PCR 方法对本试验分离到的菌株做分子生物学鉴定，结果见图4， 并且图中仅显示部分菌株的PCR 产物电泳结果。 结果显示：50 株经初步鉴定的分离菌与标准菌株ATCC 29213 均出现目的条带。

图1 包头市不同辖区奶牛子宫内膜炎葡萄球菌分离情况

图2 分离葡萄球菌菌落形态图（巴尔德帕克氏琼脂）

图3 分离葡萄球菌菌落形态图（革兰染色）

图4 葡萄球菌gap 基因PCR 产物电泳检测结果

四、讨论

1.奶牛子宫内膜炎(endometritis)又称产后子宫内膜炎，是奶牛产后仅局限于子宫发生炎症性变化的一种常见产科疾病。 引起该病的病因很多, 但病原微生物感染是其发生的直接原因。 在我国，奶牛患子宫内膜炎的情况也是非常严重的。杜光波等对淮安地区部分奶牛养殖场中患子宫内膜炎的奶牛发病规律进行调查， 结果显示： 奶牛子宫内膜炎平均发病率为34.6%。 史同瑞对黑龙江省多个奶牛养殖场进行奶牛疾病调查，结果显示：奶牛患子宫内膜炎的发病率为30%，占产科疾病发病率的24.62%。

众所周知， 治疗奶牛子宫内膜炎不仅费用高、耗精力,而且还会延长奶牛的产犊间隔,严重影响奶牛的繁殖力和生产性能, 降低了奶牛养殖业的经济效益。因此，了解哪些病原微生物对奶牛具有感染，对奶牛养殖业具有重要意义。

2.本试验从包头多个辖区（昆区、青山区、九原区以及石拐区）的各个大型养殖场、养殖基地及散养户总共采集了患子宫内膜炎奶牛的子宫分泌物120 份，共分离到葡萄球菌50 株，分离率为41.7% 。 彭宇等报道江苏省奶牛子宫内膜炎葡萄球菌的分离率为61.9%，王爽等报道黑龙江地区奶牛子宫内膜炎葡萄球菌的分离率为22.86%， 张子恒等在豫南地区母牛子宫内膜炎致病菌的分离鉴定的实验研究中，报道葡萄球菌的分离率为26.87%， 这些数据除江苏省外均比本试验实验结果低，出现这一结果可能的原因是引起奶牛子宫内膜炎的病原微生物会因地区不同而存在差异，或者是由采样局限性造成的。 本试验结果与朱宪光等报道内蒙古呼和浩特地区奶牛子宫内膜炎葡萄球菌的分离率（50.0%）相近，表明地区相同或相近奶牛子宫内膜炎葡萄球菌的分离率相近。 综上所述，葡萄球菌是引起该地区奶牛子宫内膜炎的主要病原菌之一。为指导该地区兽医临床合理用药提供科学依据。

五、结论

1.本试验从包头昆区、青山区、九原区及石拐区患子宫内膜炎奶牛的子宫分泌物中分离到葡萄球菌的分离率分别为43.3%（13∕30）；36.7%（11∕30）；40%（12∕30）；46.7%（14∕30）。

2.本试验共分离到50 株（41.7%）葡萄球菌。

[1]薛秀恒,孙茂忠,王菊花,等.安徽不同地区奶站牛奶中金黄色葡萄球菌及其肠毒素污染状况评估[J].Chinese Journal of Microecology，2012,24 (4)：1005-376.

[2]Ghebrmedhin B, Layer F,Konig W et al. Genetic Classification and Distinguishing of Staphylococcus Species Based on Different Partial gap, 16S rRNA,hsp60, rpoB, sodA, and tuf Gene Sequences [J].Clin.Microbiol, 2008, 46(3)： 1019-1025.

[3]Gilbert RO, Shin ST, Guard CL, Erb HN,Frajblat M. Prevalence of endometritis and its effects on reproductive performance of dairy cows.Theriogenology.2005,64（9）：1879-1888.

[4]杜光波，徐莉，高梦宁等. 奶牛子宫内膜炎主要病原菌的调查[J].畜牧兽医，2007，39（4）： 24-26.

[5]史同瑞，于万才，王观悦等.奶牛子宫炎发病情况调查及综合性应对措施[J].畜牧兽医科技信息，2005，08：85-86.

[6]彭宇，王一昊，朱伟云等. 产后奶牛子宫内微生物菌群动态变化及其与子宫黏液性状关系的研究[J].畜牧兽医学报,2012,43(8)：1292-1297.

[7]王爽，和翀翼，刘文等. 黑龙江地区奶牛子宫内膜炎病原菌的分离鉴定与药物敏感性试验[J].中国兽药杂志，2008，42（5）：33-35.

[8]张子恒，邓立新等. 豫南地区母牛子宫内膜炎致病菌的分离鉴定[J].中国牛业进展，2010，560-564.

[9]朱宪光，闫红霞，凤英等.呼和浩特周边地区奶牛子宫内膜炎病原菌分离鉴定及药敏试验[J].畜牧与饲料科学，2010，31（6-7）：228-229.