谯天敏，张 静，冉晓潇，朱天辉

(四川农业大学 林学院，四川 成都 611130)

解淀粉芽孢杆菌在山茶叶中的定殖及对山茶灰斑病的防效

谯天敏，张 静，冉晓潇，朱天辉

(四川农业大学 林学院，四川 成都 611130)

【目的】 解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)是从山茶叶片内部分离得到的1株内生拮抗菌株，通过研究该菌株在山茶叶片表面和内部的定殖规律及其对山茶灰斑病的田间防治效果，为新型生防制剂的开发及山茶灰斑病的生物防治提供理论依据。【方法】 采用抗生素标记法，结合比较标记菌株和非标记菌株的形态特征、拮抗能力、防病效果，筛选出最佳标记菌株；分别采用喷施和针刺法研究接种浓度、病原菌对生防菌在山茶叶表面及内部定殖动态的影响，并测定生防菌对山茶灰斑病的田间防治效果。【结果】 从含500 μg/mL链霉素抗性平板上得到最佳标记菌株，标记菌株与未标记菌株在形态特征、拮抗能力、防病效果方面均无明显差异。定殖试验表明，解淀粉芽孢杆菌能够高效定殖于山茶叶表面及内部，且叶表面的定殖较叶片内部更为高效、持久，其定殖量与接种浓度呈正相关，并在一定时间内维持相当数量，病原菌仅与叶表面定殖密切相关，与生防菌的叶内定殖无关。田间防治试验表明，生防菌解淀粉芽孢杆菌菌悬液对山茶灰斑病有显著生防效果，预先接种生防菌菌悬液后再接种病原菌的生防效果最好，防效为75.35%，先接种病原菌后喷施解淀粉芽孢杆菌菌悬液处理的防效为73.89%，同时接种生防菌菌悬液和病原菌时的防效最低，为72.95%。【结论】 生防菌株B.amyloliquefaciens能够有效定殖于山茶叶片表面及内部，且对山茶灰斑病具有显著的生物防治效果。

山茶灰斑病；芽孢杆菌；茶褐斑拟盘多毛孢菌；生物防治；定殖能力

山茶灰斑病(Camellia gray spot)是由茶褐斑拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsisguepini(Desm.)Stey)侵染所引起的一种叶部真菌性病害[1-2]。山茶灰斑病病原体在叶组织中以菌丝或分生孢子盘形式越冬，翌年春天产孢，造成扩散性为害传播[3]。受侵染的山茶植株轻者叶、梢干枯，重者整株死亡，极大地降低了山茶的经济及观赏价值[4]。目前，对该病的防治报道主要集中在化学防治方面[5]，尚未发现理想药剂及抗病品种，生物防治尚属空白。

芽孢杆菌作为新一类生防资源，对多种植株病害均具有明显的防控作用[6]。目前国内外学者对病原菌生防机制的研究主要集中在促生增强[7]、竞争定殖[8]、拮抗互作[9]和诱导抗性[10]4个方面。范晓静等[11]、闫孟红等[12]、孔庆科等[13]研究显示，相较于根际细菌来说，内生细菌适应微环境能力较强，可大大降低外界环境对自身的影响，因此研究内生细菌的竞争定殖作用对其生防制剂的开发意义重大。解淀粉芽孢杆菌是从山茶叶片内部分离得到的1株内生拮抗菌株，具有繁殖能力强、抗逆性显著、生防潜力大等基本特性[14-15]，且对多种病原真菌具有较强的抑菌活性。近年来，对解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)生物学特性的研究较多[16]，但在其定殖和生物防治方面报道甚少。本研究在对解淀粉芽孢杆菌抗生素突变菌株筛选的基础上，研究该菌在山茶叶表面和内部的定殖力，检测其对山茶灰斑病的田间防治效果，旨在为解淀粉芽孢杆菌生防制剂的高效开发提供理论依据，同时为山茶灰斑病的生物防治提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌种 拮抗菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BA10菌株，病原菌为茶褐斑拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsisguepini(Desm.)Stey)，均由四川农业大学森林保护实验室提供。

1.1.2 供试植株 西南红山茶，即七心红(Camelliapitardii),4年生，购于雅安花卉公司，种植于田间，行距1 m，株距0.5 m。

1.1.3 菌悬液制备 将活菌株接种于PDA平板培养基上，25 ℃培养5～7 d，收集分生孢子，用无菌水稀释成3×104CFU/mL的孢子悬液。将斜面上培养2 d的解淀粉芽孢杆菌BA10菌株接种于NA培养液中，旋转培养72 h，制成2×107CFU/mL的菌悬液 (用平板计数法统计初始菌液带菌量)。

1.1.4 抗生素 卡那霉素、链霉素、氨苄青霉素、氯霉素、林可霉素、庆大霉素和阿米卡星，均购自上海生物试剂公司。制备的10 μg/mL抗生素溶液经抗菌过滤膜(0.22 μm)抽滤、灭菌后，于4 ℃冰箱保存备用。

1.2 拮抗菌抗生素突变体的诱发、筛选

将解淀粉芽孢杆菌分别接种于7种抗生素抗性平板上，28 ℃下恒温培养2～3 d，进行供试菌株的天然抗药性检测，确定抗生素标记种类及初筛质量浓度。每组抗生素浓度梯度分别为10,20,50,100 μg/mL。以不加抗生素平板为空白对照，每处理重复3次。在此基础上参照郭小芳等[17]的方法，进行拮抗菌抗生素突变体的筛选。将解淀粉芽孢杆菌BA10菌株落依次接种于10,20,40,60,80,100 μg/mL初筛抗性平板上培养，筛选出稳定的突变体菌株。

1.3 BA10标记菌株与未标记菌株的比较

1.3.1 菌落形态特征 将标记菌株(1.2中筛选的突变体)与未标记菌株(原始拮抗菌)分别进行平板划线培养，28 ℃恒温培养3～5 d后，观察菌落形态特征是否发生变化。

1.3.2 拮抗活性 将标记菌株与未标记菌株与病原菌对峙培养，培养条件同1.3.1节，观察并对比培养皿中拮抗带宽度的变化，计算抑制率(抑制率=(对照病原菌直径-对峙培养病原菌直径)/对照病原菌直径×100%)均值，探究标记菌株的拮抗活性，以此判断该菌是否适合应用于山茶叶片的定殖和生物防治。

1.3.3 防病效果 将未标记菌株与标记菌株在平板上连续转代培养3次后，接种到斜面培养基上，于-4 ℃下保存30 d，活化制成浓度为2×107CFU/mL的菌悬液，分别喷施未标记菌株和标记菌株菌悬液100 mL于山茶叶片表面后，立即接种浓度为3×104CFU/mL的病原菌孢子悬液100 mL。分别在接种后第1,4,8,15天进行标记性状的稳定性检测，计算防效[3]，每株取样本15片，每处理3次重复。

1.4 标记菌株在山茶叶部定殖力的测定

1.4.1 接种浓度对解淀粉芽孢杆菌在山茶叶表面及叶内定殖的影响 以无菌水稀释解淀粉芽孢杆菌菌悬液至浓度梯度为2×104，2×105，2×106，2×107CFU/mL。(1)叶表面定殖力测定。每梯度各取100 mL，分别喷施于已消毒(体积分数75%酒精表面消毒，无菌水冲洗3～5次)山茶叶片表面。(2)叶内定殖力的测定。采用针刺伤叶接种法，具体参照Pedras等[18]对番茄叶片针刺的方法，选择长势相近的健康山茶植株10株，每株随机选择4片2年生叶片，分别用已消毒的微量进样器(0.05 mm)注射各梯度菌剂于叶内，每叶片注射1孔，每孔注射量为15 mL，3组重复，以注射等量无菌水为对照。无菌套袋15 d后拆袋，在拆袋后1，4，8，12，16，20，28，40 d时取山茶叶片，将叶片剪碎后取碎叶片5 g，研磨获得叶汁。取叶汁0.2 mL梯度稀释后的洗涤液涂抹于抗生素平板，每梯度重复3组，25 ℃培养72 h后统计菌落数。

1.4.2 病原菌对解淀粉芽孢杆菌在山茶叶表面及叶内定殖的影响 处理方法同1.4.1。叶片表面定殖力测定共设4个处理：(1)PB,先施生防菌处理。喷施2×107CFU/mL解淀粉芽孢杆菌菌悬液100 mL，7 d后喷施3×104CFU/mL病原菌孢子悬液100 mL；(2)P+B，同时施用生防菌和病原菌处理。同时喷施2×107CFU/mL解淀粉芽孢杆菌菌悬液和3×104CFU/mL病原菌孢子悬液各100 mL； (3)BP，先施病原菌处理。喷施3×104CFU/mL 病原菌孢子悬液100 mL，7 d后喷施2×107CFU/mL解淀粉芽孢杆菌菌悬液100 mL；(4)CK,只施生防菌。喷施2×107CFU/mL解淀粉芽孢杆菌菌悬液100 mL，7 d后喷施无菌水100 mL。叶片内部定殖力测定的处理方法同上，只是将各处理中喷施的2×107CFU/mL解淀粉芽孢杆菌菌悬液100 mL改为接种该菌悬液15 mL。

1.4.3 解淀粉芽孢杆菌对山茶灰斑病的防治效果 对已灭菌叶片的试验处理共分5组，每处理10株，3个重复。处理1(预先接种病原菌)：先喷施3×104CFU/mL 的病原菌孢子悬液100 mL，7 d后再喷施2×107CFU/mL解淀粉芽孢杆菌菌悬液100 mL于山茶叶片表面；处理2(同时接种生防菌与病原菌)：先喷施3×104CFU/mL病原菌孢子悬液100 mL后，立即喷施2×107CFU/mL的解淀粉芽孢杆菌菌悬液100 mL于叶片表面；处理3 (预先接种生防菌)：先喷施2×107CFU/mL的解淀粉芽孢杆菌菌悬液100 mL，7 d后再喷施3×104CFU/mL的病原菌孢子悬液100 mL于叶片表面；处理4：喷施3×104CFU/mL 的病原菌孢子悬液100 mL；处理5：喷施清水。以上各处理组在处理、对照、重复期间均需无菌套袋处理，在接种完成后的第8天开始再无菌套袋培养15 d，分别于拆袋后的0，5，10，15，20 d统计发病情况。对未灭菌叶片的试验处理，除在喷施菌液前需用体积分数75%的酒精对叶片进行表面消毒外，其他步骤同上。参照李姝江等[3]的病情分级标准计算病情指数和防病效果。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌抗生素种类及突变体的筛选

抗生素标记试验表明，解淀粉芽孢杆菌在链霉素质量浓度为10 μg/mL时菌落生长较好，但在更高质量浓度下无法生长；在含10 μg/mL阿米卡星平板上也能产生单菌落，但菌落较为稀疏；在10，20，50，100 μg/mL的林可霉素抗性平板上均可生长，而在其余抗生素平板均不能生长。由此可知，链霉素是标记解淀粉芽孢杆菌的最佳抗生素，初筛质量浓度为10 μg/mL。在此基础上，依次划线向更高质量浓度的链霉素抗性平板上培养，直至不再长出菌落为止，最终在含500 μg/mL链霉素抗性平板上得到目的菌株。

2.2 标记菌株与未标记菌株的比较

2.2.1 菌落形态特征 划线培养2 d后，标记菌株与未标记菌株相似，但颜色略显暗淡，出现不透明白色菌落。在显微镜下观察其形如杆状，表体不光滑，菌落边缘不整齐，与未标记菌株大体一致。

2.2.2 拮抗能力 对峙培养比较发现，标记菌株抑菌圈直径均值达到1.55 cm，抑菌率均值达到73.23%；而未标记菌株的抑菌圈直径均值达到 1.59 cm，抑菌率均值达到75.89%，说明标记后菌株对病原菌的抑制作用并未受到太大的影响，可用于山茶灰斑病的定殖和生防研究。

2.2.3 防病效果 由表1可知，标记菌株与未标记菌株对山茶灰斑病的生防效果几乎一致，推断标记菌株仍具有较强的生防活性，可以作为抗性标记菌株进行定殖试验研究。

表1 标记菌株与未标记菌株对茶褐斑拟盘多毛孢菌的防效Table 1 Control effects of unmarked strain and marked strain against Pestalotipsis guepini

注:表中数据均为3次重复的平均值；小写英文字母表示0.05显著差异水平(SSR测验)。

Note:All data are the average of three repeats.Small letters mean significant difference at 0.05 level (SSR test).

2.3 接种浓度对生防菌定殖的影响

2.3.1 对山茶叶片表面定殖的影响 图1表明，生防菌在山茶叶片上的定殖量与其接种浓度明显相关，接种初始浓度越高，生防菌的定殖量越大，定殖能力越强；当生防菌定殖量达到最大时，其数值均略高于拆袋后第1天的接种量，且增量高低与初始浓度值呈负相关；在检测周期内， 4种不同接种浓度处理几乎同时 (8 d左右)达到菌量最大值，后呈现缓慢下降趋势，最终趋于平稳；2×107CFU/mL和2×106CFU/mL的定殖浓度较其他2组处理具有明显优势，可以作为田间定殖和防治的优选浓度。

图1 接种浓度对解淀粉芽孢杆菌在山茶叶片表面定殖的影响B.叶部菌量；B7.2×107 CFU/mL；B6.2×106 CFU/mL；B5.2×105 CFU/mL；B4.2×104 CFU/mLFig.1 Effect of inoculated concentration on colonization of Bacillus amyloliquefaciens on leaves of camellia B.Concentration of strains on leaves;B7.2×107 CFU/mL;B6.2×106 CFU/mL;B5.2×105 CFU/mL;B4.2×104 CFU/mL

图2 接种浓度对解淀粉芽孢杆菌在山茶叶片内部定殖的影响B.叶部菌量；B7.2×107 CFU/mL；B6.2×106 CFU/mL；B5.2×105 CFU/mL；B4.2×104 CFU/mLFig.2 Effect of inoculated concentration on colonization of Bacillus amyloliquefaciens in leaves of camelliaB.Concentration of strains in leaves;B7.2×107 CFU/mL;B6.2×106 CFU/mL;B5.2×105 CFU/mL;B4.2×104 CFU/mL

2.3.2 对山茶叶内定殖的影响 图2显示，不同接种浓度下生防菌定殖量随时间变化曲线的波动差别较为明显，生防菌定殖量的高低与接种浓度呈正相关，即接种浓度越高生防菌在山茶叶内的定殖量也就越大，接种浓度低则生防菌的定殖量小；各接种浓度下定殖量的峰值，均大幅度高于第1天的定殖量；拆袋16 d后随接种时间的延长，定殖菌量急剧减少。

由图2可知，与叶表面定殖相比，叶片内部定殖的菌量变化不明显，拆袋16 d后才达到最大峰，明显较叶表面定殖时的最大值出现晚，且叶表面定殖的菌量远远高于叶内部定殖的菌量。由图2可以进一步看出，内部定殖稳定性强，且不同接种浓度对内部定殖的终菌量无显著性影响。由此推知，低浓度的内部定殖也能较好地应用于田间的生物防治。

2.4 病原菌对生防菌定殖的影响

2.4.1 对山茶叶片表面定殖的影响 图3表明，接种病原菌后山茶叶片表面的生防菌浓度发生明显变化，特别是在拆袋第8天后，各处理生防菌量急剧减少；不接种病原菌的对照处理在拆袋40 d时的定殖量为3.2×105CFU/mL，另外3组处理在40 d时的定殖量均较低，为0.948×103～1.214×103CFU/mL。先施病原菌和先施生防菌的2组处理，前期与对照的定殖量相似，但后期其定殖量急剧下降，最终远远低于对照；同时施用病原菌和生防菌的处理组，定殖量下降速度很快，其最终生防菌浓度与前2组处理几乎一致。

图3 茶褐斑拟盘多毛孢菌对解淀粉芽孢杆菌在山茶叶表面定殖的影响
-◆-.PB(先施生防菌)；-■-.P+B(同时施用生防菌和病原菌)；-▲-.BP(先施病原菌)；-×-.CK(只施生防菌)
Fig.3 Effects ofPestalotipsisguepinion colonization ofBacillusamyloliquefacienson camellia leaves
-◆-.PB(Biocontrol strains first);-■-.P+B(Biocontrol strains and pathogens together);-▲-.BP(Pathogens first);-×-.CK(Biocontrol strains only)

图4 茶褐斑拟盘多毛孢菌对解淀粉芽孢杆菌在山茶叶片内部定殖的影响
-◆-.PB.(先施生防菌)；-■-.P+B(同时施生防菌和病原菌)；-▲-.BP(先施病原菌)；-×-.CK(只施生防菌)
Fig.4 Effects ofPestalotipsisguepinion colonization ofBacillusamyloliquefaciensin camellia leaves
-◆-.PB(Biocontrol strains first); -■-.P+B(Biocontrol strains and pathogens together);-▲-.BP(Pathogens first);-×-.CK(Biocontrol strains only)

2.4.2 对山茶叶内定殖的影响 由图4可知，定殖菌量在拆袋后第1～4 天内浓度略有下降，后呈缓慢增长态势，从第12天迅速上涨，于16 d时到达峰值，而后又呈下降态势，并在20～28 d后基本趋于稳定。最终4个处理的定殖量无显著差异。病原菌几乎对生防菌的叶内定殖没有影响，所有处理的变化趋势均与对照相同。各处理的定殖浓度均略低于对照，但以同时施加茶褐斑拟盘多毛孢菌和解淀粉芽孢杆菌的处理组最低，其原因可能是在用微量进样器将生防菌注射到叶片内部的过程中，引起了病原菌的小范围入侵，改变了叶片内部的微环境，从而对生防菌的定殖生长产生了抑制作用。

2.5 解淀粉芽孢杆菌对山茶灰斑病的防治效果

防治试验结果(表2)表明，生防菌解淀粉芽孢杆菌菌悬液对山茶灰斑病有显著的生防效果。拆袋后5 d，防治效果略微下降，可能是拆袋后外部环境条件发生变化，抑制了解淀粉芽孢杆菌拮抗物质的产生，后期呈现上升趋势，于15 d时达到最佳，最后逐渐趋于稳定。从接种方式上看，灭菌叶组中预先接种解淀粉芽孢杆菌菌悬液处理的生防效果最好，防效达到75.35%，显著高于另2种处理(P<0.05)；后喷施菌悬液处理组的防效也较好，防效达73.89%；解淀粉芽孢杆菌菌悬液和病原菌同时接种组的防效最低，但其防效也达到72.95%。关于叶片自身携带微生物对试验结果的影响，由表1可知，叶片表面灭菌与否对试验结果并无显著影响。图5～8 表明，解淀粉芽孢杆菌能够有效地用于山茶灰斑病的田间生物防治，且防治效果较为显著。

3 结论与讨论

本研究使用的解淀粉芽孢杆菌生防真菌是从山茶叶片内部分离得到的1株内生拮抗菌株，有关该菌株在山茶叶表面及内部定殖能力的研究尚未见报道。Pinho等[19]认为，内生生防菌在植株上的稳定定殖和拮抗强弱是其生防机制的先决条件；与此同时，许多学者指出，生防菌株在寄主植株的定殖位点是其生防效率高低的重要衡量因子[20-22]；高效、稳定的标记菌株是防病效果的前提保障。本研究采用抗生素标记法[23]对解淀粉芽孢杆菌菌株进行筛选，最终在含500 μg/mL链霉素抗性平板上得到突变菌株，且标记菌株在形态特征、拮抗能力、防病效果方面均与未标记菌株无明显差异，这与冉淦侨等[24]的研究结果相似，故该标记菌株能够很好地应用于山茶灰斑病的定殖研究，为山茶灰斑病的生防研究提供了重要的前提条件。

注：表中各数据均为3次重复的平均值；差异性分析为同列比较，小写英文字母表示在0.05水平上差异显著(LSD 法)。

Note:All data are the average of three replicates.Difference analysis is in vertical comparison.Lowercase letters mean significant difference atP=0.05 level (LSD).

图5 无菌水处理的山茶叶片Fig.5 Leaves of camellia treated with sterile water

图6 病原菌处理的山茶叶片 Fig.6 Leaves of camellia treated with pathogens

图7 预先接种解淀粉芽孢杆菌的山茶叶片
Fig.7 Leaves of camellia treated withBacillusamyloliquefaciensfirstly

图8 同时接种病原菌和解淀粉芽孢杆菌的山茶叶片
Fig.8 Leaves of camellia treated withBacillusamyloliquefaciensand pathogens at the same time

目前，有关生防菌定殖的报道主要集中在土壤和植物根际方面，而在叶片表面和内部定殖动态的研究尚比较少[25]，研究中又以外部分离筛选得到的拮抗菌株居多，这类生防菌易受外界环境条件的影响，容易出现不能定殖或定殖后防病效果不稳定等问题，而对于内生生防菌定殖的报道甚少[26]。本研究表明，解淀粉芽孢杆菌在山茶叶片表面及叶片内部均能够高效定殖，且在叶片表面的定殖较叶片内部更为高效、持久，其定殖量与接种浓度呈正相关，并可在一定时间内维持相当数量，这一结论充分证明解淀粉芽孢杆菌完全具备生防制剂菌株选择的基本条件，将其以生防制剂的形式用于山茶灰斑病的防治，具有较高的理论性和实践性，也使得山茶灰斑病的生物防治成为可能。

田间防治试验结果表明，先喷施生防菌解淀粉芽孢杆菌菌悬液与同时喷施生防菌液和病原菌孢子悬液处理组的生防效果差异明显，而后喷施解淀粉芽孢杆菌菌悬液处理组的生防效果也较好，可能是由于解淀粉芽孢杆菌具有较强的定殖竞争作用，可以占领病原菌与寄主植株的结合位点，从而抑制病原菌的侵入，但对于其生防机制的确定还有待于进一步研究。已有研究表明，解淀粉芽孢杆菌菌株在山茶灰斑病新型生防制剂的开发方面具有广阔的前景，也为解决山茶灰斑病化学防治中的环境污染、诱导抗药性、药剂残留等问题提供了新的思路。

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Colonization ofBacillusamyloliquefaciensin camellia leaves and its control efficacy against camellia gray spot

QIAO Tian-min,ZHANG Jing,RAN Xiao-xiao,ZHU Tian-hui

(CollegeofForestry,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu,Sichuan611130,China)

【Objective】Bacillusamyloliquefaciensis one of the endogenous antagonistic strains separated from the internal camellia leaf.This study investigated the colonization ofB.amyloliquefaciensin camellia leaves and its control efficacy on against camellia gray spot to provide references for the development of new bio-control agents and biological control of camellia disease.【Method】 A mutant strain ofB.amyloliquefaciensresistant to streptomycin was screened and obtained with the antibiotic label method,and the contrast tests for morphological characteristics,antagonism abilities,and control effects were conducted.The colonization trials in camellia leaves with different inoculation concentrations and pathogens were determined with the spraying method and needle puncturing method.Field trials were also conducted.【Result】 The optimal marked strain was obtained from the resistant plating medium with streptomycin of 500 μg/mL.The morphological characteristics,antagonism abilities,and control effects of the marked strain were not significantly different from the unmarked strains.The colonization trials showed thatB.amyloliquefacienscould efficiently colonize on the surface and inside of camellia leaves.In addition,it colonized more efficient and durable on surface of leaves than the inside.The population of colonization was positively correlated with the inoculated concentration,and maintained considerable number at a certain time.The pathogen was related with the surface colonization,but not to inside colonization.The control tests in the field showed that biocontrol strain suspension had significant effect on camellia gray spot.The effect of inoculating pathogen after biocontrol strain was best with the rate of 75.35%.The effect of inoculating pathogen before biocontrol strain was 73.89%.The effect of inoculating biocontrol strain and the pathogen simultaneously was the lowest with rate of 72.95%.【Conclusion】 The bio-control strainB.amyloliquefacienscan effectively colonize in both the surface and inside of camellia leaves,and it possessed strong bi-control effects against camellia gray spot.

camellia gray spot;Bacillaceae;Pestalotiopsisguepini(Desm.)Stey;biological control;colonizing capacity

时间:2015-09-09 15:41

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.10.011

2014-03-10

国家自然科技资源共享平台项目(2005DKA21207-13)

谯天敏(1972-)，女，四川南充人，副研究员，博士，主要从事林木病理学研究。E-mail:525636693@qq.com

朱天辉(1963-)，男，重庆开县人，教授，博士生导师，主要从事林木病理学研究。E-mail:zhuth1227@126.com

S685.140.8

A

1671-9387(2015)10-0077-08

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150909.1541.022.html