于月华+张跃强+倪志勇+海热古力·阿不力孜

摘要：脱水应答元件结合蛋白在高等植物应答干旱、高盐和低温胁迫中发挥重要的作用。根据GenBank中小麦（Triticum aestivum L.）DREB基因的cDNA序列设计引物，采用RT-PCR技术从小麦中克隆了DREB基因837 bp的编码区。为进一步研究小麦DREB基因的功能，以pMD18-T-DREB质粒为模板，PCR扩增DREB基因片段，构建了该基因的植物表达载体。经菌液PCR和测序鉴定后，转化到农杆菌LBA4404中，为通过转基因技术深入研究小麦DREB基因的功能奠定了基础。

关键词：植物表达载体;小麦（Triticum aestivum L.）;DREB基因

中图分类号：Q78           文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）12-2925-03

Cloning of DREB Gene of Triticum aestivum and Construction of Its Plant Expression Vectors

YU Yue-hua1， ZHANG Yue-qiang2， NI Zhi-yong1， HAIREGULI·ABULIZI2

（1. College of Agronomy/Key Laboratory of Agricultural Biological Technology， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052， China;

2. Institute of Nuclear and Biological Technologies， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Urumqi 830091， China）

Abstract： Dehydration-responsive element binding protein played critical roles in the response to dehydration， salinity， and cold stresses in higher plants. Primers were designed according to the cDNA sequence of wheat DREB gene in Genbank， a length of 837 bp from cDNA of DREB gene was cloned by RT-PCR. To investigate the function of DREB gene in wheat，the plant expression vector of DREB gene was constructed. The full-length open reading frame of DREB gene was amplified by PCR using pMD18-T-DREB as template. PCR and sequencing results showed that plant expression vector of DREB gene was constructed successfully. This constructed vector was then transformed into Agrobacterium LBA4404. This constructed vector provided an effective tool for the further study of DREB gene function.

Key words： plant expression vector; wheat（Triticum aestivum L.）; DREB gene

高等植物中脱水应答元件结合蛋白（Dehydration-responsive element binding protein，DREB）在应答脱水、高盐和冷胁迫中具有重要的作用[1，2]。DREB转录因子通过结合目标基因启动子区域中的脱水应答元件DREs/CRTs，提高转基因植物对干旱、高盐和冷胁迫的耐受性[3，4]。通过在模式植物中过表达DREB基因，已经揭示了许多植物的DREB基因在逆境胁迫应答中的作用[5]。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中过表达大麦（Hordeum vulgare L.）HvDREB1基因，在正常生长条件下激活下游基因RD29A的表达，提高转基因拟南芥对盐胁迫的忍耐能力[6]。过表达水稻（Oryza sativa L.）OsDREB1A基因的转基因拟南芥植物，在正常生长条件下激活目标基因的表达，提高转基因植物对干旱和低温的耐受性[7]。过表达大豆（Glycine max Merr.）GmDREB2基因提高转基因植物对干旱和高盐的忍耐能力[8]。因此，通过控制DREB转录因子的表达有可能提高多种作物对非生物胁迫的忍耐能力[9]。目前，已经从许多植物中克隆了DREB基因，包括水稻[7]、玉米（Zea mays L.）[10]、大豆[8]和小麦（Triticum aestivum L.）[11，12]。

小麦是中国乃至全世界最重要的粮食作物之一[13]，中国小麦主产区主要分布在干旱、半干旱地区，提高小麦对干旱胁迫的耐受性来增加小麦产量，将极大地提高中国应对粮食安全问题的能力。本研究根据GenBank中的小麦DREB基因序列，设计带有酶切位点的引物，从新春6号小麦品种中克隆了DREB基因，构建了植物表达载体，并转入农杆菌LBA4404中，为进一步利用农杆菌介导法转化小麦奠定了基础。endprint

1  材料和方法

1.1  材料

供试小麦品种为新春6号，由新疆农业科学院核技术生物技术研究所小麦育种课题组提供。

1.2  方法

1.2.1  RNA的提取及cDNA的合成  生长10 d 新春6号小麦幼苗经20%聚乙二醇（PEG）处理6 h后取样，参照Trizol试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]使用说明，提取经PEG处理的小麦叶片总RNA。利用AMV反转录酶[宝生物工程（大连）有限公司]反转录合成cDNA第一链。取1 μg总RNA作为模板进行RT-PCR，20 μL体系中包含总RNA 1 μg，DEPC水6.5 μL，Olig（dT）15 1 μL，75 ℃保温5 min后，冰上冰浴5 min，然后依次加入0.5 μL RNase inhibitor，4 μL 5×AMV Buffer，2 μL dNTPs（10 mmol/L）和1 μL AMV（100 U/μL），25 ℃保温10 min，42 ℃温育90 min，95 ℃变性5 min，冰上冰浴5 min。

1.2.2  小麦DREB基因编码区的克隆  根据GenBank中的小麦DREB基因序列（登录号：AY781361）和植物表达载体pCAMBIA3301的酶切位点设计合成一对带有限制性内切酶的引物DREB-F：5′-TAACCATGGATGGAGACCGGGGGTAGCAA-3′和DREB-R：5′-TATAGATCTCTAATATGAGAAAAGACTAAA-3′（下划线分别为Nco I和Bgl II酶切位点），以20% PEG处理6 h的叶片cDNA第一链为模板，扩增基因编码区。50 μL体系中含cDNA（20 ng/μL） 1 μL，2×GC-PCR Buffer II 25 μL，dNTPs（10 mmol/L）2 μL，引物（25 μmol/L） 1 μL和LA Taq酶（5 U/μL）0.5 μL[宝生物工程（大连）有限公司]，补ddH2O至50 μL。PCR 程序为94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，66 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，利用紫外凝胶成像仪（Bio-Rad公司）观察结果。采用琼脂糖凝胶回收试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司]回收目的片段，将回收产物与pMD18-T[宝生物工程（大连）有限公司]载体连接后转化E. coli DH5α感受态细胞[天根生化科技（北京）有限公司]，与X-gal和IPTG涂于含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，过夜培养后挑取白色克隆，经含有氨苄青霉素的液体培养基振荡培养12 h。菌液PCR检测是否有插入片段，并阳性克隆送上海美季生物技术公司测序，采用DNAMAN软件分析比对测序结果。

1.2.3  小麦DREB基因表达载体的构建及鉴定  以含有小麦DREB基因编码区的pMD18-T-DREB质粒为模板，使用DREB-F和DREB-R引物，用高保真酶[宝生物工程（大连）有限公司]扩增两端带有Nco I和Bgl II酶切位点的小麦DREB基因编码区序列。PCR扩增体系和扩增程序同上。获得的小麦DREB基因PCR产物，凝胶回收后，用Nco I和Bgl II（Fermentas公司）酶切PCR回收产物和表达载体pCAMBIA3301质粒。50 μL体系中包含：质粒或PCR产物（5 μg）10 μL，Nco I 5 μL，Bgl II 5 μL，10×Fast Digest Buffer 5 μL和ddH2O 25 μL。回收双酶切产物，用T4 DNA连接酶（Fermentas公司）将DREB片段连接到pCAMBIA3301载体中，22 ℃孵育10 min。连接产物转化E. coli DH5α感受态细胞[天根生化科技（北京）有限公司]。菌液PCR鉴定构建的DREB基因植物表达载体，并将阳性克隆送上海美季生物技术公司测序。

1.2.4  小麦DREB基因表达载体转化农杆菌  LBA

4404提取小麦DREB基因表达载体pCAMBIA3301-DREB的质粒，以冻融法将质粒转化农杆菌LBA4404感受态细胞。具体方法参照倪志勇等[14]的方法。

2  结果与分析

2.1  小麦DREB基因编码区的克隆及序列比对

根据GenBank中的小麦DREB基因序列（登录号：AY781361），设计一对带有酶切位点的引物，用RT-PCR方法从经20% PEG处理6 h的新春6号小麦叶片中扩增到DREB基因的编码区，扩增片段大小为837 bp（图1）。将扩增片段连接到克隆载体pMD18-T，测序后与GenBank中的小麦DREB基因序列进行比对，结果表明两个序列完全一致，说明获得的小麦DREB基因编码区是正确的，没有发生碱基变化，可以用来构建植物表达载体。

2.2  小麦DREB基因表达载体的构建

用前向带有Nco I和反向带有Bgl II酶切位点的小麦DREB基因引物，以pMD18-T-DREB质粒为模板，经PCR扩增获得两端带有Nco I和Bgl II酶切位点的小麦DREB基因编码区片段，扩增产物大小约837 bp，与预期大小相符，且无非特异扩增带。将目的片段回收纯化后，用Nco I和Bgl II酶切，连接到用相同酶切回收后的表达载体pCAMBIA3301上，热激转化E. coli DH5α，获得pCAMBIA3301-DREB表达载体（图2）。对重组质粒用DREB-F和DREB-R引物进行PCR鉴定，能够扩增出一条长约837 bp的目的基因条带（图3）。将阳性克隆测序，序列比对结果正确，说明小麦DREB基因表达载体构建成功。endprint

2.3  小麦DREB基因表达载体转化农杆菌LBA4404

将构建好的植物表达载体pCAMBIA3301-DREB通过冻融法导入农杆菌LBA4404中，用利福平和卡那霉素进行筛选，待转化子菌落长出后，挑取单菌落摇菌，采用DREB-F和DREB-R引物进行农杆菌菌液PCR鉴定，经琼脂糖凝胶电泳检测。由图4可以看出，能够从转化表达载体的农杆菌菌液中获得大小为837 bp的目的片段，表明含有DREB基因的植物表达载体已成功转入农杆菌LBA4404中，可直接用于后续的小麦转化工作。

3  小结与讨论

新春6号小麦品种对高温和干旱的抗性较强，是新疆春小麦超高产品种[15]。为了获得抗旱性基因，本研究根据GenBank中小麦DREB基因的序列，从新疆小麦品种新春6号中克隆了该基因的编码区序列，序列比对发现获得的DREB编码区序列与GenBank中的小麦DREB基因序列完全一致，没有发生碱基的变化。将该编码区序列克隆到植物表达载体pCAMBIA3301中并转化农杆菌LBA4404中，为使用农杆菌浸染的方法转化小麦品种打下基础。

参考文献：

[1]LIU Q，KASUGA M，SAKUMA Y，et al.Two transcription factors，DREB1 and DREB2，with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought- and low temperature-responsive gene expression， respectively，in Arabidopsis[J].Plant Cell，1998，10（8）：1391-1406.

[2] AGARWAL P K，AGARWAL P，REDDY M K，et al.Role of DREB transcription factors in abiotic and biotic stress tolerance in plants[J].Plant Cell Rep，2006，25（12）：1263-1274.

[3] YAMAGUCHI-SHINOZAKI K，SHINOZAKI K.A novel cis-acting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought，low-temperature，or high-salt stress[J].Plan Cell，1994，6（2）：251-264.

[4] BAKER S S，WILHELM K S，THOMASHOW M F.The 5-region of Arabidopsis thaliana cor15a has cis-acting eleme ntsthat confer cold，drought-and ABA-regulated gene expression [J].Plant Molecular Biology，1994，24（5）：701-713.

[5] 倪志勇，徐兆师，李连城，等.DREB转录因子在植物抗逆胁迫中的作用机理及应用研究进展[J].麦类作物学报，2008，28（6）：1100-1106.

[6] XU Z S，NI Z Y，LI Z Y，et al.Isolation and functional characterization of HvDREB1-a gene encoding a dehydration-responsive element binding protein in Hordeum vulgare[J].J Plant Res，2009，122（1）：121-130.

[7] DUBOUZET J G，SAKUMA Y，ITO Y，et al.OsDREB genes in rice， Oryza sativa L.， encode transcription activators that function in drought-，high-salt-and cold-responsive gene expression[J].Plant J，2003，33（4）：751-763.

[8] CHEN M，WANG Q Y，CHENG X G，et al.GmDREB2，a soybean DRE-binding transcription factor，conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants[J]. Biochem Biophys Res Commun，2007，353（2）：299-305.

[9] 刘  强，赵南明，YAMAGUCHI-SHINOZAKI K，等.DREB转录因子在提高植物抗逆性的作用[J].科学通报，2000，45（1）：11-16.

[10] QIN F，SAKUMA Y，LI J，et al.Cloning and functional analysis of a novel DREB1/CBF transcription factor involved in cold-responsive gene expression in Zea mays L.[J].Plant Cell Physiol，2004，45（8）：1042-1052.

[11] 倪志勇，徐兆师，刘  丽，等.小麦转录因子TaDREB6基因的克隆及鉴定[J].麦类作物学报，2008，28（3）：357-363.

[12] XU Z S， NI Z Y， LIU L， et al. Characterization of the TaAIDFa gene encoding a CRT/DRE-binding factor responsive to drought， high-salt， and cold stress in wheat[J]. Mol Genet Genomics，2008，280（6）：497-508.

[13] VASIL T K，ANDERSON O D.Genetic engineering of wheat gluten[J].Trends Plant Sci，1997，2（8）：292-297.

[14] 倪志勇，马文静，吕  萌，等. 棉花肉桂醇脱氢酶基因GhCAD6的克隆及正义、反义与RNAi干扰载体的构建[J].华北农学报，2009，24（6）：20-26.

[15] 吴振录. 新疆春小麦超高产育种及超高产品种新春6号的育成[J].新疆农业科学，1994（2）：57-59.endprint

2.3  小麦DREB基因表达载体转化农杆菌LBA4404

将构建好的植物表达载体pCAMBIA3301-DREB通过冻融法导入农杆菌LBA4404中，用利福平和卡那霉素进行筛选，待转化子菌落长出后，挑取单菌落摇菌，采用DREB-F和DREB-R引物进行农杆菌菌液PCR鉴定，经琼脂糖凝胶电泳检测。由图4可以看出，能够从转化表达载体的农杆菌菌液中获得大小为837 bp的目的片段，表明含有DREB基因的植物表达载体已成功转入农杆菌LBA4404中，可直接用于后续的小麦转化工作。

3  小结与讨论

新春6号小麦品种对高温和干旱的抗性较强，是新疆春小麦超高产品种[15]。为了获得抗旱性基因，本研究根据GenBank中小麦DREB基因的序列，从新疆小麦品种新春6号中克隆了该基因的编码区序列，序列比对发现获得的DREB编码区序列与GenBank中的小麦DREB基因序列完全一致，没有发生碱基的变化。将该编码区序列克隆到植物表达载体pCAMBIA3301中并转化农杆菌LBA4404中，为使用农杆菌浸染的方法转化小麦品种打下基础。

参考文献：

[1]LIU Q，KASUGA M，SAKUMA Y，et al.Two transcription factors，DREB1 and DREB2，with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought- and low temperature-responsive gene expression， respectively，in Arabidopsis[J].Plant Cell，1998，10（8）：1391-1406.

[2] AGARWAL P K，AGARWAL P，REDDY M K，et al.Role of DREB transcription factors in abiotic and biotic stress tolerance in plants[J].Plant Cell Rep，2006，25（12）：1263-1274.

[3] YAMAGUCHI-SHINOZAKI K，SHINOZAKI K.A novel cis-acting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought，low-temperature，or high-salt stress[J].Plan Cell，1994，6（2）：251-264.

[4] BAKER S S，WILHELM K S，THOMASHOW M F.The 5-region of Arabidopsis thaliana cor15a has cis-acting eleme ntsthat confer cold，drought-and ABA-regulated gene expression [J].Plant Molecular Biology，1994，24（5）：701-713.

[5] 倪志勇，徐兆师，李连城，等.DREB转录因子在植物抗逆胁迫中的作用机理及应用研究进展[J].麦类作物学报，2008，28（6）：1100-1106.

[6] XU Z S，NI Z Y，LI Z Y，et al.Isolation and functional characterization of HvDREB1-a gene encoding a dehydration-responsive element binding protein in Hordeum vulgare[J].J Plant Res，2009，122（1）：121-130.

[7] DUBOUZET J G，SAKUMA Y，ITO Y，et al.OsDREB genes in rice， Oryza sativa L.， encode transcription activators that function in drought-，high-salt-and cold-responsive gene expression[J].Plant J，2003，33（4）：751-763.

[8] CHEN M，WANG Q Y，CHENG X G，et al.GmDREB2，a soybean DRE-binding transcription factor，conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants[J]. Biochem Biophys Res Commun，2007，353（2）：299-305.

[9] 刘  强，赵南明，YAMAGUCHI-SHINOZAKI K，等.DREB转录因子在提高植物抗逆性的作用[J].科学通报，2000，45（1）：11-16.

[10] QIN F，SAKUMA Y，LI J，et al.Cloning and functional analysis of a novel DREB1/CBF transcription factor involved in cold-responsive gene expression in Zea mays L.[J].Plant Cell Physiol，2004，45（8）：1042-1052.

[11] 倪志勇，徐兆师，刘  丽，等.小麦转录因子TaDREB6基因的克隆及鉴定[J].麦类作物学报，2008，28（3）：357-363.

[12] XU Z S， NI Z Y， LIU L， et al. Characterization of the TaAIDFa gene encoding a CRT/DRE-binding factor responsive to drought， high-salt， and cold stress in wheat[J]. Mol Genet Genomics，2008，280（6）：497-508.

[13] VASIL T K，ANDERSON O D.Genetic engineering of wheat gluten[J].Trends Plant Sci，1997，2（8）：292-297.

[14] 倪志勇，马文静，吕  萌，等. 棉花肉桂醇脱氢酶基因GhCAD6的克隆及正义、反义与RNAi干扰载体的构建[J].华北农学报，2009，24（6）：20-26.

[15] 吴振录. 新疆春小麦超高产育种及超高产品种新春6号的育成[J].新疆农业科学，1994（2）：57-59.endprint

2.3  小麦DREB基因表达载体转化农杆菌LBA4404

将构建好的植物表达载体pCAMBIA3301-DREB通过冻融法导入农杆菌LBA4404中，用利福平和卡那霉素进行筛选，待转化子菌落长出后，挑取单菌落摇菌，采用DREB-F和DREB-R引物进行农杆菌菌液PCR鉴定，经琼脂糖凝胶电泳检测。由图4可以看出，能够从转化表达载体的农杆菌菌液中获得大小为837 bp的目的片段，表明含有DREB基因的植物表达载体已成功转入农杆菌LBA4404中，可直接用于后续的小麦转化工作。

3  小结与讨论

新春6号小麦品种对高温和干旱的抗性较强，是新疆春小麦超高产品种[15]。为了获得抗旱性基因，本研究根据GenBank中小麦DREB基因的序列，从新疆小麦品种新春6号中克隆了该基因的编码区序列，序列比对发现获得的DREB编码区序列与GenBank中的小麦DREB基因序列完全一致，没有发生碱基的变化。将该编码区序列克隆到植物表达载体pCAMBIA3301中并转化农杆菌LBA4404中，为使用农杆菌浸染的方法转化小麦品种打下基础。

参考文献：

[1]LIU Q，KASUGA M，SAKUMA Y，et al.Two transcription factors，DREB1 and DREB2，with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought- and low temperature-responsive gene expression， respectively，in Arabidopsis[J].Plant Cell，1998，10（8）：1391-1406.

[2] AGARWAL P K，AGARWAL P，REDDY M K，et al.Role of DREB transcription factors in abiotic and biotic stress tolerance in plants[J].Plant Cell Rep，2006，25（12）：1263-1274.

[3] YAMAGUCHI-SHINOZAKI K，SHINOZAKI K.A novel cis-acting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought，low-temperature，or high-salt stress[J].Plan Cell，1994，6（2）：251-264.

[4] BAKER S S，WILHELM K S，THOMASHOW M F.The 5-region of Arabidopsis thaliana cor15a has cis-acting eleme ntsthat confer cold，drought-and ABA-regulated gene expression [J].Plant Molecular Biology，1994，24（5）：701-713.

[5] 倪志勇，徐兆师，李连城，等.DREB转录因子在植物抗逆胁迫中的作用机理及应用研究进展[J].麦类作物学报，2008，28（6）：1100-1106.

[6] XU Z S，NI Z Y，LI Z Y，et al.Isolation and functional characterization of HvDREB1-a gene encoding a dehydration-responsive element binding protein in Hordeum vulgare[J].J Plant Res，2009，122（1）：121-130.

[7] DUBOUZET J G，SAKUMA Y，ITO Y，et al.OsDREB genes in rice， Oryza sativa L.， encode transcription activators that function in drought-，high-salt-and cold-responsive gene expression[J].Plant J，2003，33（4）：751-763.

[8] CHEN M，WANG Q Y，CHENG X G，et al.GmDREB2，a soybean DRE-binding transcription factor，conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants[J]. Biochem Biophys Res Commun，2007，353（2）：299-305.

[9] 刘  强，赵南明，YAMAGUCHI-SHINOZAKI K，等.DREB转录因子在提高植物抗逆性的作用[J].科学通报，2000，45（1）：11-16.

[10] QIN F，SAKUMA Y，LI J，et al.Cloning and functional analysis of a novel DREB1/CBF transcription factor involved in cold-responsive gene expression in Zea mays L.[J].Plant Cell Physiol，2004，45（8）：1042-1052.

[11] 倪志勇，徐兆师，刘  丽，等.小麦转录因子TaDREB6基因的克隆及鉴定[J].麦类作物学报，2008，28（3）：357-363.

[12] XU Z S， NI Z Y， LIU L， et al. Characterization of the TaAIDFa gene encoding a CRT/DRE-binding factor responsive to drought， high-salt， and cold stress in wheat[J]. Mol Genet Genomics，2008，280（6）：497-508.

[13] VASIL T K，ANDERSON O D.Genetic engineering of wheat gluten[J].Trends Plant Sci，1997，2（8）：292-297.

[14] 倪志勇，马文静，吕  萌，等. 棉花肉桂醇脱氢酶基因GhCAD6的克隆及正义、反义与RNAi干扰载体的构建[J].华北农学报，2009，24（6）：20-26.

[15] 吴振录. 新疆春小麦超高产育种及超高产品种新春6号的育成[J].新疆农业科学，1994（2）：57-59.endprint