李小玲+华智锐

摘要：为研究了春兰（Cymbidium goeringii）基因组DNA的最佳提取方法，以商洛野生春兰为试验材料，分别采用SDS法、CTAB法、高盐CTAB法提取了春兰基因组DNA。结果表明，高盐CTAB法提取效果较好，其次是CTAB法，SDS法提取效果最差。

关键词：春兰（Cymbidium goeringii）;DNA提取;浓度;纯度

中图分类号：Q943.2        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）12-2923-02

Comparative Studies on Extracting Genome DNA of Cymbidium goeringii

LI Xiao-ling，HUA Zhi-rui

（Department of Biomedical Medicine Engineering，Shangluo University，Shangluo 726000，Shaanxi，China）

Abstract： To explore the optimal genomic DNA extraction method of Cymbidium goeringii，with wild Cymbidium goeringii in Shangluo as experimental material， genomic DNA of wild Cymbidium goeringii has been extracted by the method of SDS，CTAB and high salt CTAB. The results showed that high salt CTAB was the best of three methods， followed by CTAB and SDS.

Key words： Cymbidium goeringii;DNA extraction;concentration;purity

春兰（Cymbidium goeringii）又名草兰、山兰，是国兰中栽培与观赏历史最为悠久的种类之一。目前，对春兰的研究主要集中在组织培养[1，2]、栽培[3]、非共生萌发[4]和共生菌[5，6]等方面，而对春兰分子遗传学方面的研究报道较少[1，7]。获得高质量的基因组DNA是分子遗传学研究的基础。兰科植物组织细胞中含有大量酚类、多糖等次生代谢产物，给基因组DNA的提取造成了困难。酚类物质容易氧化，氧化后与DNA形成共价结合而导致DNA褐变，引起DNA的丢失;多糖类物质容易与DNA产生沉淀，导致DNA样品的流失[8]。本研究采用SDS法、CTAB法、高盐CTAB法[1，7]提取商洛野生春兰基因组DNA，探索最适合春兰基因组DNA的提取方法，旨在为今后春兰种质资源学及其种群遗传结构研究提供依据。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  春兰的采集与预处理  试验材料采于商洛市板桥镇下弯村海拔约750 m处的林下阴坡，将采回的兰花种于花盆中并放置阴凉处备用。DNA提取前1 d，剪取健康完整的春兰幼嫩叶片，将叶片上残留的杂质用去离子水冲洗干净，用滤纸将水吸干，待室温晾干后用灭过菌的剪刀将兰花剪成碎片，用纸包好，保存于-20 ℃冰箱中备用。

1.1.2  主要试剂  三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）、硼酸（Boric acid）、聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）、十二烷基硫酸钠（SDS）、溴化十二烷基三甲基铵（CTAB）、琼脂糖、超纯水、溴化乙锭（EB）、氯仿、异戊醇、浓盐酸、固体氢氧化钠、氯化钠、无水乙醇、β-巯基乙醇均购自西安沃尔森生物技术有限公司。

1.1.3  主要仪器  高压蒸汽灭菌锅、HNZ-2-2F型垂直流行超净工作台（上海苏进仪器设备厂监制，南通沪南科学仪器有限公司制造）;FA2004N型电子天平、U755B型紫外可见光分光光度计（上海精密科学仪器有限公司制造）;H2050R型台式高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）;GelDoc 2000凝胶成像系统（美国Bio·Rad公司）等。

1.2  方法

1.2.1  基因组DNA的提取  ①称取0.2 g春兰叶片，用去离子水冲洗干净，并用滤纸吸干水分。②将叶片剪成1 cm左右碎片，放入预冷的瓷研钵中，迅速加入液氮，将植物材料研磨成细粉（越细越好）并迅速转入2 mL离心管中。③在2 mL离心管中加入3种预热的抽提缓冲液1 mL，65 ℃保温1 h，保温期间应该轻轻颠倒摇匀。④用高速冷冻离心机15 000 r/min离心10 min，将上清转入另一个新的离心管中，用移液器转移上清液时应缓慢，防止将沉淀吸入。⑤加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1），混匀抽提至水乳胶融状，用高速冷冻离心机15 000 r/min离心10 min。⑥将上清转入另一个新的离心管中。加入等体积-20 ℃预冷无水乙醇，-20 ℃静置45 min，缓缓混匀DNA成絮状折出。⑦用高速冷冻离心机15 000 r/min离心10 min，缓慢弃上清液。DNA沉淀用70%乙醇洗2次，室温风干。洗涤时用移液器沿离心管的管壁缓慢注入，防止将DNA冲洗下来。⑧加入100 μL的TE缓冲液，室温下溶解DNA至沉淀完全消失，-20 ℃静置保存。

1.2.2  基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测  配制1%琼脂糖凝胶进行电泳检测基因组DNA，并采用凝胶成像系统观察照相并保存。endprint

1.2.3  紫外分光光度法检测DNA的浓度和纯度    分别测定基因组DNA在260 nm、280 nm时的吸光度。每次换待测样品时，必须调零。计算待测样品的浓度与纯度。

根据A260 nm=1时，dsDNA浓度约为50 μg/mL，DNA浓度计算公式为：DNA浓度（μg/mL）=A260 nm×50 μg/mL×稀释倍数。

春兰基因组DNA提取率以每克鲜重春兰叶片提取到的基因组DNA的微克数表示，DNA提取率计算公式为：提取率=DNA浓度×体积/样重。

2  结果与分析

2.1  商洛野生春兰基因组DNA电泳结果

采用SDS法、CTAB法、高盐CTAB法3种方法提取春兰基因组DNA后，将提取到的基因组DNA 以1%琼脂糖凝胶进行电泳，检测结果如图1。从图1可以看出，3种方法均能提取到基因组DNA，点样孔附近白色的片段为基因组DNA。基因组DNA比较大，所以在凝胶中迁移的速率较慢，其中泳道5～泳道12的基因组DNA明显比泳道1～泳道4更大、更亮，说明CTAB法和高盐CTAB法提取到的基因组DNA比SDS法提取的浓度更高，即SDS法效果较差。3种方法所提取的基因组DNA的电泳条带均有轻微的拖尾现象，原因可能是春兰材料在储存和操作过程中产生了DNA的部分降解，从图1可以明显看出，基因组DNA有部分降解为约2 000 bp大小的DNA片段。

2.2  紫外分光光度计测定DNA浓度和提取率结果

采用SDS法、CTAB法、高盐CTAB法3种方法提取春兰基因组DNA后，使用紫外分光光度计测其在260 nm和280 nm的吸光度，计算出DNA浓度和DNA提取率，结果如表1所示。

纯度高的DNA A260 nm/A280 nm在1.7～1.9之间，当A260 nm/A280 nm为1.8时，纯度最高。低于此范围表明所提取的DNA有蛋白质、酚类污染;高于此范围表明样品中含有RNA污染。

由表1可知，SDS法、CTAB法、高盐CTAB法提取的DNA A260 nm/A280 nm分别为1.576、1.654、1.835。高盐CTAB法提取的DNA纯度较高，而SDS法和CTAB法的A260 nm/A280 nm均小于1.8，表明有蛋白质污染，且SDS法提取到的基因组DNA污染较严重。3种方法提取到的DNA的浓度为高盐CTAB法>CTAB法>SDS法;DNA的提取率为高盐CTAB法>CTAB法>SDS法。

综合比较，高盐CTAB法提取效果较好，其次是CTAB法，最差的是SDS法。

3  小结与讨论

植物体内的组织和器官含有酚类、多糖类、色素类等物质，在植物基因组DNA提取过程中容易受到这些物质的干扰。酚类杂质的存在，氧化后会络合DNA分子，产生褐色杂质;多糖类杂质会粘连DNA分子，形成胶状复合物，导致DNA难以溶解。3种方法所提取的DNA电泳条带均有轻微的拖尾现象，原因可能是春兰材料在储存和操作过程中产生了DNA部分降解，降解的原因很多，如外界物理因素（温度、湿度）。本研究用3种方法提取商洛野生春兰基因组DNA，通过比较初步得出高盐CTAB法优于CTAB法和SDS法，对于春兰基因组DNA提取方法的具体优化方面还有待进一步研究。

参考文献：

[1] 刘  阳，陈小强，孙  宁，等.大花蕙兰子房基因组DNA提取方法的比较研究[J].天津农学院学报，2012，19（2）：14-18.

[2] 陈惠云，孙志栋，茅轶俊，等.春兰基因组DNA提取方法的研究[J].分子植物育种，2006，4（1）：135-142.

[3] 周  全，余  平.春兰根状茎的增殖与分化条件优化[J].湖北农业科学，2009，48（1）：27-30.

[4] 王永清，余道平.春兰根状茎离体培养[J].园艺学报，2005（4）：706-706.

[5] 赵  虎，封  宸，邢  海，等.春兰提前开花的栽培试验[J].浙江农业科学，2008（1）：37-38.

[6] 李  丽，罗君琴，王海琴.春兰种子非共生萌发的研究[J].福建热作科技，2007（3）：127-130.

[7] 司更花，朱国鹏.五唇兰基因组DNA提取方法的优化[J].热带林业，2012，40（2）：37-39.

[8] 梁红健，刘  敏，林  鸣.中国兰花（Chinese Cymbidium）部分品种的叶片同工酶分析[J].生物实验学报，1997（3）：343-348.endprint

1.2.3  紫外分光光度法检测DNA的浓度和纯度    分别测定基因组DNA在260 nm、280 nm时的吸光度。每次换待测样品时，必须调零。计算待测样品的浓度与纯度。

根据A260 nm=1时，dsDNA浓度约为50 μg/mL，DNA浓度计算公式为：DNA浓度（μg/mL）=A260 nm×50 μg/mL×稀释倍数。

春兰基因组DNA提取率以每克鲜重春兰叶片提取到的基因组DNA的微克数表示，DNA提取率计算公式为：提取率=DNA浓度×体积/样重。

2  结果与分析

2.1  商洛野生春兰基因组DNA电泳结果

采用SDS法、CTAB法、高盐CTAB法3种方法提取春兰基因组DNA后，将提取到的基因组DNA 以1%琼脂糖凝胶进行电泳，检测结果如图1。从图1可以看出，3种方法均能提取到基因组DNA，点样孔附近白色的片段为基因组DNA。基因组DNA比较大，所以在凝胶中迁移的速率较慢，其中泳道5～泳道12的基因组DNA明显比泳道1～泳道4更大、更亮，说明CTAB法和高盐CTAB法提取到的基因组DNA比SDS法提取的浓度更高，即SDS法效果较差。3种方法所提取的基因组DNA的电泳条带均有轻微的拖尾现象，原因可能是春兰材料在储存和操作过程中产生了DNA的部分降解，从图1可以明显看出，基因组DNA有部分降解为约2 000 bp大小的DNA片段。

2.2  紫外分光光度计测定DNA浓度和提取率结果

采用SDS法、CTAB法、高盐CTAB法3种方法提取春兰基因组DNA后，使用紫外分光光度计测其在260 nm和280 nm的吸光度，计算出DNA浓度和DNA提取率，结果如表1所示。

纯度高的DNA A260 nm/A280 nm在1.7～1.9之间，当A260 nm/A280 nm为1.8时，纯度最高。低于此范围表明所提取的DNA有蛋白质、酚类污染;高于此范围表明样品中含有RNA污染。

由表1可知，SDS法、CTAB法、高盐CTAB法提取的DNA A260 nm/A280 nm分别为1.576、1.654、1.835。高盐CTAB法提取的DNA纯度较高，而SDS法和CTAB法的A260 nm/A280 nm均小于1.8，表明有蛋白质污染，且SDS法提取到的基因组DNA污染较严重。3种方法提取到的DNA的浓度为高盐CTAB法>CTAB法>SDS法;DNA的提取率为高盐CTAB法>CTAB法>SDS法。

综合比较，高盐CTAB法提取效果较好，其次是CTAB法，最差的是SDS法。

3  小结与讨论

植物体内的组织和器官含有酚类、多糖类、色素类等物质，在植物基因组DNA提取过程中容易受到这些物质的干扰。酚类杂质的存在，氧化后会络合DNA分子，产生褐色杂质;多糖类杂质会粘连DNA分子，形成胶状复合物，导致DNA难以溶解。3种方法所提取的DNA电泳条带均有轻微的拖尾现象，原因可能是春兰材料在储存和操作过程中产生了DNA部分降解，降解的原因很多，如外界物理因素（温度、湿度）。本研究用3种方法提取商洛野生春兰基因组DNA，通过比较初步得出高盐CTAB法优于CTAB法和SDS法，对于春兰基因组DNA提取方法的具体优化方面还有待进一步研究。

参考文献：

[1] 刘  阳，陈小强，孙  宁，等.大花蕙兰子房基因组DNA提取方法的比较研究[J].天津农学院学报，2012，19（2）：14-18.

[2] 陈惠云，孙志栋，茅轶俊，等.春兰基因组DNA提取方法的研究[J].分子植物育种，2006，4（1）：135-142.

[3] 周  全，余  平.春兰根状茎的增殖与分化条件优化[J].湖北农业科学，2009，48（1）：27-30.

[4] 王永清，余道平.春兰根状茎离体培养[J].园艺学报，2005（4）：706-706.

[5] 赵  虎，封  宸，邢  海，等.春兰提前开花的栽培试验[J].浙江农业科学，2008（1）：37-38.

[6] 李  丽，罗君琴，王海琴.春兰种子非共生萌发的研究[J].福建热作科技，2007（3）：127-130.

[7] 司更花，朱国鹏.五唇兰基因组DNA提取方法的优化[J].热带林业，2012，40（2）：37-39.

[8] 梁红健，刘  敏，林  鸣.中国兰花（Chinese Cymbidium）部分品种的叶片同工酶分析[J].生物实验学报，1997（3）：343-348.endprint

1.2.3  紫外分光光度法检测DNA的浓度和纯度    分别测定基因组DNA在260 nm、280 nm时的吸光度。每次换待测样品时，必须调零。计算待测样品的浓度与纯度。

根据A260 nm=1时，dsDNA浓度约为50 μg/mL，DNA浓度计算公式为：DNA浓度（μg/mL）=A260 nm×50 μg/mL×稀释倍数。

春兰基因组DNA提取率以每克鲜重春兰叶片提取到的基因组DNA的微克数表示，DNA提取率计算公式为：提取率=DNA浓度×体积/样重。

2  结果与分析

2.1  商洛野生春兰基因组DNA电泳结果

采用SDS法、CTAB法、高盐CTAB法3种方法提取春兰基因组DNA后，将提取到的基因组DNA 以1%琼脂糖凝胶进行电泳，检测结果如图1。从图1可以看出，3种方法均能提取到基因组DNA，点样孔附近白色的片段为基因组DNA。基因组DNA比较大，所以在凝胶中迁移的速率较慢，其中泳道5～泳道12的基因组DNA明显比泳道1～泳道4更大、更亮，说明CTAB法和高盐CTAB法提取到的基因组DNA比SDS法提取的浓度更高，即SDS法效果较差。3种方法所提取的基因组DNA的电泳条带均有轻微的拖尾现象，原因可能是春兰材料在储存和操作过程中产生了DNA的部分降解，从图1可以明显看出，基因组DNA有部分降解为约2 000 bp大小的DNA片段。

2.2  紫外分光光度计测定DNA浓度和提取率结果

采用SDS法、CTAB法、高盐CTAB法3种方法提取春兰基因组DNA后，使用紫外分光光度计测其在260 nm和280 nm的吸光度，计算出DNA浓度和DNA提取率，结果如表1所示。

纯度高的DNA A260 nm/A280 nm在1.7～1.9之间，当A260 nm/A280 nm为1.8时，纯度最高。低于此范围表明所提取的DNA有蛋白质、酚类污染;高于此范围表明样品中含有RNA污染。

由表1可知，SDS法、CTAB法、高盐CTAB法提取的DNA A260 nm/A280 nm分别为1.576、1.654、1.835。高盐CTAB法提取的DNA纯度较高，而SDS法和CTAB法的A260 nm/A280 nm均小于1.8，表明有蛋白质污染，且SDS法提取到的基因组DNA污染较严重。3种方法提取到的DNA的浓度为高盐CTAB法>CTAB法>SDS法;DNA的提取率为高盐CTAB法>CTAB法>SDS法。

综合比较，高盐CTAB法提取效果较好，其次是CTAB法，最差的是SDS法。

3  小结与讨论

植物体内的组织和器官含有酚类、多糖类、色素类等物质，在植物基因组DNA提取过程中容易受到这些物质的干扰。酚类杂质的存在，氧化后会络合DNA分子，产生褐色杂质;多糖类杂质会粘连DNA分子，形成胶状复合物，导致DNA难以溶解。3种方法所提取的DNA电泳条带均有轻微的拖尾现象，原因可能是春兰材料在储存和操作过程中产生了DNA部分降解，降解的原因很多，如外界物理因素（温度、湿度）。本研究用3种方法提取商洛野生春兰基因组DNA，通过比较初步得出高盐CTAB法优于CTAB法和SDS法，对于春兰基因组DNA提取方法的具体优化方面还有待进一步研究。

参考文献：

[1] 刘  阳，陈小强，孙  宁，等.大花蕙兰子房基因组DNA提取方法的比较研究[J].天津农学院学报，2012，19（2）：14-18.

[2] 陈惠云，孙志栋，茅轶俊，等.春兰基因组DNA提取方法的研究[J].分子植物育种，2006，4（1）：135-142.

[3] 周  全，余  平.春兰根状茎的增殖与分化条件优化[J].湖北农业科学，2009，48（1）：27-30.

[4] 王永清，余道平.春兰根状茎离体培养[J].园艺学报，2005（4）：706-706.

[5] 赵  虎，封  宸，邢  海，等.春兰提前开花的栽培试验[J].浙江农业科学，2008（1）：37-38.

[6] 李  丽，罗君琴，王海琴.春兰种子非共生萌发的研究[J].福建热作科技，2007（3）：127-130.

[7] 司更花，朱国鹏.五唇兰基因组DNA提取方法的优化[J].热带林业，2012，40（2）：37-39.

[8] 梁红健，刘  敏，林  鸣.中国兰花（Chinese Cymbidium）部分品种的叶片同工酶分析[J].生物实验学报，1997（3）：343-348.endprint