张伟德，李光学，马 锐，刘清蒙

(1.贵州航天医院肝胆外科,贵州遵义 563000;2 贵州航天医院普外科,贵州遵义 563000;3.遵义医学院免疫学教研室,贵州遵义 563003;4.遵义医学院微生物学教研室,贵州遵义 563003)

·经验交流·

肝癌患者外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg与IL-2 IL-10 TGF-β表达的动态观察及临床意义

张伟德1，李光学2，马 锐3，刘清蒙4

(1.贵州航天医院肝胆外科,贵州遵义 563000;2 贵州航天医院普外科,贵州遵义 563000;3.遵义医学院免疫学教研室,贵州遵义 563003;4.遵义医学院微生物学教研室,贵州遵义 563003)

目的 了解CD4+CD25+FOXP3+Treg、IL-2、IL-10和TGF-β在肝癌患者外周血中的表达并探讨其临床意义。方法应用流式细胞术测定32例原发性肝癌(HCC组)和17例继发性肝癌(SHC组)患者治疗前、治疗后1、3、6个月外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg占CD4+T淋巴细胞百分比，用ELISA法测定IL-2、IL-10和TGF-β的水平，并与18例对照者进行比较。结果HCC和SHC患者治疗前和治疗后外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg占CD4+T细胞的比例、IL-10和TGF-β水平均显著高于对照组(P<0.01)；IL-2显著低于对照组(P<0.01)；治疗后各时间点(治疗后1、3、6个月)CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T淋巴细胞百分比、IL-2、IL-10和TGF-β差异均无统计学意义(P<0.05)。结论CD4+CD25+FOXP3+Treg、IL-10和TGF-β在肝癌患者外周血中表达水平明显升高，IL-2明显降低。检测它们的表达水平对肝癌的辅助诊断及治疗具有重要临床意义。

肝肿瘤；Foxp3；白细胞介素2；白细胞介素10；转化生长因子β

调节性T 细胞(regulatory T cell,Treg)是一类可以调节多种免疫细胞功能的T细胞亚型，其在维持机体内环境稳定、预防自身免疫性疾病、控制移植物排斥反应中发挥着重要作用。Treg的数量和功能失调与多种重大疾病的发生发展和结局密切相关。研究表明，体内Treg特别是CD4+CD25+Foxp3+Treg水平，可能与肿瘤的发生发展与结局有密切关系[1-3]。白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)能刺激已被特异性抗原或致丝裂原启动的T细胞增殖，使其杀伤活性增强，进而清除体内肿瘤细胞和病毒感染细胞[4]。IL-10是由肿瘤细胞分泌的能使其逃避免疫监视的一种免疫抑制因子[5]。转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)对免疫活性细胞增殖、淋巴细胞分化、细胞因子产生具有抑制作用、其可诱导某些原癌基因表达和具有双向免疫调节功能[6-8]。因此，了解肿瘤患者体内Treg及IL-2、IL-10和TGF-β的水平，对肿瘤的预防、诊断和治疗都会产生积极的作用。本文动态测定了原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)及继发性肝癌(secondary hepatocarcinoma,SHC)患者外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg、IL-2、IL-10和TGF-β的水平，探讨其与肝癌的可能临床意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料 32例HCC患者，男20例,女12例,年龄38～66岁；17例SHC，男11例,女6例,年龄34～61岁。所有患者经病理确诊，由贵州航天医院、遵义医学院第一附属医院和遵义市医院收治。18名健康志愿者作为对照组,男12名,女6名,年龄36～56岁。均无任何急、慢性疾病史，亦无自身免疫性疾病病史或家族史。所有参试者试验前均未行任何放疗或化疗，3个月内未使用过任何免疫抑制剂。

1.2 主要试剂和仪器 抗CD4-藻红蛋白(CD4-PE)、抗CD25-异硫氰酸荧光素(CD25-FITC)和抗FOXP3-AOC均为BD公司产品，红细胞裂解液为Solarbio公司产品；Coulter EpicsXL 流式细胞仪(美国Beckman-Coulter公司)；溶血仪(美国Beckman-Coulter公司)。

1.3 方法

1.3.1 CD4+CD25+FOXP3+Treg的检测 试验对象均于清晨空腹抽取静脉血2 mL加肝素抗凝后，静置6 h后送检。CD4+CD25+和CD4+CD25+FOXP3+细胞染色，严格按试剂说明书规定操作，主要流程为：取肝素抗凝静脉血1 mL,加入红细胞裂解液混匀，4 ℃静置15 min，其间混匀2次，离心，收集细胞，以PBS洗涤后，调整细胞数至1×104，加入抗CD4-FITC和抗CD25-PE单克隆抗体各10 μL，室温暗室孵育20 min，以PBS洗涤，加入抗Foxp3-AOC单克隆抗体10 μL,室温暗室孵育2 h 30 min，PBS洗涤，细胞重悬后经流式细胞仪测定，数据经Cell Quest软件获取和分析。

1.3.2 IL-2、IL-10和TGF-β的检测 所有样本均于早晨空腹采集静脉血2 mL，分离血清，-80 ℃保存待测。IL-2、IL-10 及TGF-β均采用ELISA 双抗夹心法酶标仪测定，试剂盒由上海森雄科技实业有限公司提供，严格按说明书规定操作。

2 结 果

2.1 肝癌患者CD4+CD25+FOXP3+Treg及IL-2、IL-10和TGF-β水平 由表1可见治疗前HCC组与SHC组患者外周血T细胞亚群CD4+CD25+FOXP3+Treg占CD4+T细胞比例差异无统计学意义(P>0.05)，而HCC组和SHC组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。HCC组与SHC组IL-2、IL-10和TGF-β水平组间差异无统计学意义(P>0.05),但与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 治疗前、后HCC患者CD4+CD25+FOXP3+Treg及IL-2、IL-10和TGF-β水平 HCC组治疗前与治疗后比较，患者CD4+CD25+FOXP3+Treg占CD4+T细胞比例无显著差异，但与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；IL-2水平，治疗后各组均显著高于治疗前(P<0.01)，但治疗前与治疗后各组均显著低于对照组(P<0.01)；IL-10和TGF-β水平，治疗前均显著高于治疗后各组(P<0.01)，但治疗前和治疗后各组仍然明显高于对照组(P<0.01)，治疗后各时间点(治疗后1、3、6个月)均无明显差异，见表2。

2.3 治疗前、后SHC患者CD4+CD25+FOXP3+Treg及IL-2、IL-10和TGF-β水平 SHC组治疗前与治疗后各组比较，CD4+CD25+FoXP3+Treg占CD4+T细胞比例差异无统计学意义，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。IL-2水平，治疗后显著高于治疗前(P<0.05),但治疗前、治疗后均显著低于对照组(均P<0.01)。IL-10和TGF-β水平，患者治疗前均显著低于治疗后各组(P<0.01)，治疗前和治疗后各组均高于对照组(P<0.01)，但治疗后各时间点(治疗后1、3、6个月)差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表1 肝癌患者与对照组外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg(%)及IL-2、IL-10和TGF-β水平

Treg:CD4+CD25+FOXP3+Treg。

表2 治疗后HCC患者与对照组外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg及IL-2、IL-10和TGF-β水平

Treg:CD4+CD25+FOXP3+Treg。

表3 治疗后SHC患者与对照组外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg及IL-2、IL-10和TGF-β水平

Treg:CD4+CD25+FOXP3+Treg。

A：HCC；B：SHC。

图1 HCC、SHC患者CD4+CD25+Foxp3+T细胞流式细胞仪检测图

3 讨 论

肿瘤的发生发展及结局与机体的免疫功能正常与否密切相关，肿瘤的发生是恶变细胞逃避免疫监视的结果。Treg可经细胞接触依赖或抑制性细胞因子依赖机制主动抑制自身免疫性T 细胞的活化，维持自身免疫耐受，防止自身免疫病的发生。现认为FOXP3是自然Treg分化的重要分子，是Treg的特异性标志。FOXP3+Treg的增加可以促进肿瘤生长，抑制机体抗肿瘤免疫应答[9]。IL-2作为一种重要的免疫增强因子，其可提高机体的抗肿瘤免疫功能，达到抑制肿瘤生长的作用[4]。IL-10具有多向生物学活性，其能抑制抗原递呈细胞提呈肿瘤相关抗原，从而抑制T细胞对恶性细胞产生有效的免疫应答，有助肿瘤的免疫逃逸。Tang 等[10]认为TGF-β信号的改变诱导癌症干细胞转变成HCC，且肿瘤源性TGF-β通过抑制免疫监视或刺激血管生长因子的产生促进肿瘤生长。肿瘤细胞选择性失去了对TGF-β介导的生长抑制的反应而保留其他功能性TGF-β信号通路从而表现出其促进肿瘤转移和侵袭的特性[8]。故检测CD4+CD25+FOXP3+Treg占CD4+T 细胞的比例可了解体内具有调节活性的Treg的数量，检测IL-2、IL-10和TGF-β可了解机体免疫功能状态，特别是对肿瘤患者，具有重要的理论和临床意义。

本研究结果显示原发性和继发性肝癌患者外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg占CD4+T细胞的比例，治疗前与治疗后均明显高于对照组，治疗后1、3、6个月结果无明显差异。IL-2治疗前显著低于对照组，治疗后虽有所升高，但仍低于对照组。IL-10和TGF-β治疗前均显著高于对照组，治疗后虽有明显下降，但仍然显著高于正常对照组。CD4+CD25+FOXP3+Treg、IL-2、IL-10和TGF-β表达水平，在治疗后1、3、6个月之间结果无明显差异。提示：(1)肝癌患者外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg高表达，应是肝癌发病的原因之一，而不是肝癌发生的后果。如进一步研究规范检测规程，CD4+CD25+FOXP3+Treg的检测或可作为肝癌初筛和辅助诊断指标之一;(2)通过提高内源性IL-2的分泌和(或)输入外源性IL-2，应可在一定程度增强肝癌的治疗效果;(3)阻断或降低TGF-β的表达，干扰或抑制TGF-β对癌干细胞的诱导作用，可为肝癌的治疗提供新途径和新靶点。

肝细胞癌是世界上第五大常见实质性恶性肿瘤和第三大癌症致死原因。每年超过60 万人死于该疾病[11]。传统的化学治疗和放射治疗效果不佳，因而患者预后极差。近年来的研究证实，Treg介导的免疫抑制是肿瘤免疫逃逸的一种关键机制，也是肿瘤免疫治疗的主要障碍。如能进一步研究肿瘤免疫逃逸的详细机制，采取恰当手段，改变和/或减弱，甚至消除机体对肿瘤免疫耐受状态，同时维持活化的正常免疫效应细胞，而又不至于诱发严重的自身免疫应答，定会为肝癌的综合治疗提供新思路新途径。

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张伟德(1969-),副主任医师，主要从事肿瘤免疫学研究。

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.16.039

R735.7

B

1671-8348(2015)16-2264-03

2014-11-08

2015-03-16)