刘娜娜(

三门峡职业技术学院,河南省三门峡市，472000)

固定化漆酶在SBR处理造纸废水中的应用

刘娜娜(

三门峡职业技术学院,河南省三门峡市，472000)

固定化漆酶投入反应器处理造纸废水，当进水COD为1265.87 mg/L，固定化酶组COD去除率为65.64%，对照组COD去除率为61.42%，COD去除率提高了6.87%。提高进水负荷至1641.31 mg/L，固定化酶组COD去除率为58.76%，对照组COD去除率为47.94%，COD去除率提高了22.57%，说明反应器接入固定化漆酶后抗进水负荷冲击能力提高。当进水pH改变时，固定化酶组反应器具有较高的COD去除率。说明反应器接入固定化漆酶后抗进水pH冲击能力提高。

固定化漆酶造纸废水

近年来，漆酶在诸多领域的潜在应用价值已引起了研究者的兴趣，如环境污染物的脱毒、食品性质的改良、造纸工业、环保工业等方面广泛应用。尤其重要的是漆酶具有降解木质素的能力[1,2]，可用于纸浆中残余木质素的去除和造纸废水的生物降解，对降低生产成本和减少环境污染有着重要意义[3]。

固定化漆酶是指将水溶性漆酶以物理或化学的方法固定在有机或无机的载体上，形成不溶于水的具有酶活性的酶衍生物。本文利用包埋法对漆酶进行固定。包埋法是将漆酶物理包埋于高聚物网格内或微囊内的方法，一般反应条件温和，对酶自身的结构改变很少，因此酶活性损失较小，固定化效率较高。包埋漆酶常用的材料有聚丙烯酰胺、海藻酸钙、琼脂糖凝胶等。

固定化漆酶延长了漆酶的使用寿命，降低了漆酶的使用成本，提高了漆酶的稳定性及其对环境的耐受性，让漆酶在工业废水处理等方面的应用前景更为广阔。

1 实验部分

1.1 实验材料

1.1.1 实验菌株

云芝为本实验室保藏菌株。

1.1.2 废水及活性污泥

造纸废水取自河南省新乡市某造纸厂。废水成分复杂，含有COD、BOD、SS、木质素、氯化物、硫化物和挥发酚等多种成分。废水呈棕黑色浊状，COD高达125062.8 mg/L，pH为7.0～8.0，废水在使用前做适当稀释。

活性污泥取自河南省新乡市某造纸厂污水处理站沉淀池，其工艺为水解酸化－好氧生物工艺。

1.1.3 培养基

（1）斜面培养基：马铃薯葡萄糖培养基(Potato dextrose agar，PDA)[4]。

（2）PDA培养液：同PDA培养基，只是不加琼脂。

（3）云芝产酶液[5]：麦芽糖质量浓度为1.8 g/L，酒石酸铵质量浓度为0.84 g/L，大量元素体积分数为100 ml/L，微量元素体积分数为25 ml/L，VB1质量为100μg，吐温80质量浓度为0.05%，pH为3.6。其中大量元素组成为(质量浓度)：KH2PO420 g/L，MgSO4·7H2O 5.0 g/L，CaCl20.75 g/L。微量元素的组成为[6](质量浓度)：NaCl 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 3.0 g/ L，FeSO4·7H2O 100 mg/L，CoSO4·7H2O 100 mg/L，CaCl2100 mg/L，ZnSO4·7H2O 100 mg/L，CuSO4·5H2O 10 mg/L，KAl(SO4)100 mg/L，H3BO310 mg/L，NaMoO410 mg/L，次氮基三乙酸1.5 g/L。

图1 云芝产漆酶曲线

1.1.4 化学试剂

2，2＇-连氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸) (简称ABTS、Sigma公司)、海藻酸钠、氯化钙等。

1.2 实验方法

1.2.1 固定化漆酶方法

取斜面保藏云芝转接入灭菌PDA平板培养6 d，挑取均匀菌丝接入装有250 mL灭菌产酶液的500 mL三角瓶中，于28℃，110 r/min恒温振荡培养，每天测定漆酶活性，绘制产酶曲线。

云芝产漆酶曲线如图1所示，在培养前期(前3 d内)菌丝体快速萌发。至第5 d，培养液中菌丝球数量明显增多，体积由小变大，边缘呈绒毛状，菌体生长达到高峰。到第9 d酶活力为706 U/L，达到高峰，菌体一直处于稳定生长阶段，随后酶活力逐渐下降，菌丝球密度最大。

将培养9 d的云芝产酶液用8层纱布过滤，滤液即为漆酶粗酶液，将粗酶液与2%的海藻酸钠混合均匀，用注射器滴入4%的CaCl2中，立刻形成光滑微球，置于4℃冰箱过夜钙化，用蒸馏水冲洗3次，可放冰箱保存。

1.2.2 漆酶活性测定方法[7]

漆酶(游离酶)酶活测定方法：

室温下，0.5 mmol/L的2，2＇-连氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)(简称ABTS)1 mL，加入1 mL稀释酶液启动反应，测定420 nm处最初3 min内反应液吸光值的变化量。以酶液事先灭活后的反应混合液为对照，酶活定义为：反应体系中每分钟引起0.001个吸光值增加所需的酶量为一个酶活单位。已知ABTS氧化产物在420 nm处的摩尔消光系数ε为3.6×104M-1·cm-1。

固定化漆酶酶活测定方法：

0.5 mmol/L的ABTS 2 mL，加入16个固定化小球(等效1mL酶液)，测定420 nm处3 min内吸光值变化，初始吸光值设为0。

2 结果与分析

将固定化云芝漆酶200 mL投入SBR反应器中，为实验组。并另设条件相同的反应器为对照组。

反应器在26℃恒温下运行，周期为8.5 h，进水10 min，曝气反应7 h，沉降30 min，出水和闲置50 min。

2.1 投加固定化漆酶对反应器处理能力及污泥性质的影响

反应器中投入固定化云芝漆酶，运行10周期，测定固定化漆酶组与对照组出水COD、出水SS、MLSS、MLVSS、SV30、SVI，考察固定化云芝漆酶在反应器处理造纸废水中的应用。

进水COD为1265.87 mg/L，运行10周期，对照组平均出水COD为488.39 mg/L，投加固定化漆酶反应器的平均出水COD为435.27 mg/L，各周期COD去除率如图2所示。

固定化漆酶组比对照组COD去除率高，前者均值为65.64%，后者均值为61.42%，提高了6.87%。表明固定化漆酶的加入提高了SBR的COD去除率。因为造纸废水的主要污染物是木质素，漆酶具有降解木质素的能力，可用于木质素的去除和造纸废水的生物降解。固定化漆酶的加入有利于将木质素大分子降解为易被降解的小分子物质，这些易被降解的小分子物质可被活性污泥降解，从而提高了反应器对造纸废水的降解能力。

固定化漆酶组平均出水SS为154 mg/L，对照组平均出水SS为120 mg/L，固定化漆酶组比对照组出水SS增加28.33%，说明固定化酶颗粒不能有效地对废水中的悬浮颗粒进行吸附。

由表1可知：SBR系统中引入固定化漆酶后，固定化漆酶组比对照组MLSS、MLVSS有所增加。说明固定化漆酶的投加不影响活性污泥的生长；SV30，SVI仍然较小，说明固定化漆酶的介入对原有活性污泥体系没有不良影响，污泥没有发生污泥膨胀，仍具有良好的沉降性能。但SV30，SVI均有显著增加，可能是固定化漆酶引入反应器运行一段时间后，固定化材料海藻酸钠颗粒有所破碎且海藻酸钠颗粒比重较小，使得固定化酶反应器SV30，SVI均有显著增加。

2.2 投加固定化漆酶对反应器抗进水负荷能力的影响

进水负荷由1265.87 mg/L提高至1641.31 mg/L，运行7周期，测定固定化漆酶组与对照组的MLSS、MLVSS、出水SS、SV30、SVI、出水COD，计算COD去除率。考察固定化云芝漆酶在高进水负荷条件下在SBR中的应用。

固定化漆酶组平均出水COD为676.80 mg/L，平均COD去除率为58.76%，对照组平均出水COD为854.49 mg/L，平均COD去除率为47.94%。固定化漆酶组比对照组COD去除率提高22.57%。如图3所示。说明反应器接入固定化漆酶后抵抗进水负荷的冲击能力提高。这主要是因为固定化漆酶在较高木质素浓度下，也能有效地降解木质素，将木质素大分子降解为小分子物质，提高活性污泥在高进水负荷条件下的废水处理能力。

固定化漆酶组平均出水SS为234 mg/L，对照组平均出水SS为243 mg/L，出水SS较大，说明高进水负荷不利于固定化漆酶组和对照组出水水质的提高，固定化漆酶反应器中固定化酶颗粒不能有效地对废水中的悬浮颗粒进行吸附，而对照组在高进水负荷下废水中悬浮颗粒增多，不利于出水SS的去除。

运行7个周期，测定每个周期活性污泥的各项指标，结果如表2。SBR系统中引入固定化漆酶后，固定化漆酶组比对照组MLSS、MLVSS有所增加。说明在较高进水负荷条件下，固定化酶的介入对活性污泥生长影响不大，污泥仍然正常生长；SV30，SVI仍然较小，说明污泥没有发生污泥膨胀，仍具有良好的沉降性能。但SV30，SVI均有显著增加，可能是固定化漆酶引入反应器运行一段时间后，固定化材料海藻酸钠颗粒有所破碎且海藻酸钠颗粒比重较小，使得固定化酶反应器SV30，SVI均有显著增加。

2.3 投加固定化漆酶对反应器进水pH缓冲能力的影响

通过加酸、加碱来调节进水pH，测定在不同进水pH条件下，固定化云芝漆酶在反应器中的应用。在不同进水pH条件下COD去除率如表3所示。结果表明：无论是固定化漆酶反应器还是对照反应器，进水pH的变化都会影响废水的COD去除率。但这种影响对固定化漆酶反应器和对照反应器的影响存在差异。对于固定化漆酶反应器，进水pH向酸性变化，COD去除率有一定增加，进水pH向碱性变化，COD去除率有一定下降。当pH降低至6.0时，COD去除率增加了2.50%，当pH增加至8.0时，COD去除率下降了2.87%。对于对照组，进水pH为中性时COD去除率最高，进水pH向酸性或碱性变化，COD去除率都有一定下降，向酸性变化时的影响更大。当pH降低至6.0时，对照组的COD去除率下降了6.56%，当pH增加至8.0时，对照组的COD去除率降低了2.43%。数据表明固定化漆酶组比对照组抗酸碱变化的缓冲能力强，对酸性方向变化的缓冲能力更强，COD去除率提高。这可能是因为固定化云芝漆酶的最佳pH范围偏酸性，在进水pH偏酸的条件下，固定化云芝漆酶对木质素的降解能力更强。

2.4 反应器运行对固定化漆酶的影响

固定化漆酶投入反应器，运行5周期，测定固定化漆酶的酶活及颗粒性能。考察固定化漆酶的使用稳定性。结果如表4所示。

固定化漆酶在反应器中的酶活损失率较小，但由于反应器的搅拌作用，固定化颗粒性能会受到影响，固定化漆酶颗粒弹性差且易碎，在下阶段实验中应进一步提高固定化颗粒的机械性能。由于酶易受各种因素(如机械外力、盐浓度、pH及有机溶剂等)的干扰而变性失活，且酶的价格高，使得固定化漆酶在废水处理中的应用还存在一定的局限性。利用现代生物技术，通过有效地分离、纯化、基因表达与重组技术，大量生产便宜的酶，通过使用新型的酶固定化技术，提高酶的使用稳定性和重复利用率，从而进一步降低固定化漆酶的使用成本，延长其使用寿命，提高漆酶的稳定性及其对环境的耐受性，使漆酶在工业废水处理方面的应用前景更为广阔。

表1 活性污泥参数（进水COD为1265.87mg/L）

图2 COD去除率（进水COD为1265.87mg/L）

图3 提高负荷后COD去除率（进水COD为1641.31mg/L）

表2 提高负荷后活性污泥参数（进水COD为1641.31mg/L）

表3 不同进水pH条件下COD去除率（进水COD为1265.87mg/L）

表4 反应器运行中固定化漆酶的酶活损失率及颗粒性能

3 结论

在SBR反应器中投加200 mL的以海藻酸钠固定的云芝漆酶，提高了对造纸废水的处理能力。进水COD为1265.87 mg/L时，固定化云芝漆酶组COD去除率比对照组提高了6.87%。提高进水负荷至1641.31 mg/L，固定化云芝漆酶组比对照组COD去除率提高22.57%，SBR抵抗进水负荷的冲击能力提高。并且在不同进水pH条件下，反应器具有更强的抗pH冲击能力。固定化漆酶在反应器中的酶活损失率较小，但由于反应器的搅拌，固定化颗粒性能会受到影响。

[1]Bou RbonnaisR，Paice M．Oxidation ofnon-phenolic substances:An expanded role for laccase in lignin biodegradadation[J]．FEBSLett，1990，267：99-102．

[2]Shingo K，Masato I，Makoto N，et al．An alternative-ether cleavage pathway for a nonphenolic-O-4 lignin model dimer catalyzed by al accasemediator system[J]．Enzyme and Microbial Technology，2004，35：154-160．

[3]Rodry E，Nuero O，Guillen F，et al．Degradation of phenolic and non-phenolic aromatic pollutants by fourPleurotusspecies：Theroleoflaccaseand versatile peroxidase[J]．SoilBiology&Biochemistry，2004，36：909-916．

[4]李宗义，刘国生，李学梅．微生物学实验技术[M]．北京：气象出版社，1997：321．

[5]胡道伟，朱雄伟，梅运军等．白腐菌产漆酶培养条件的研究[J]．华中科技大学学报(自然科学版)，2003，31(4)：111-113．

[6]张朝晖，夏黎明，林建平．黄孢原毛平革菌培养合成木素过氧化酶研究[J]．浙江大学学报，1999，33 (2)：132-135．

[7]邵强，郭伟云，姚朝阳等．碳源氮源对白腐真菌漆酶合成的影响[J]．河南师范大学学报(自然科学版)，2005，33(2)：94-96．

2015－2－14