龙 兵，罗 杨，门 放

（1.四川警察学院 四川泸州 646000；2.泸州市公安局 四川泸州 646000）

混合血样DNA等位基因分型探究

龙 兵1，罗 杨2，门 放1

（1.四川警察学院 四川泸州 646000；2.泸州市公安局 四川泸州 646000）

以人体混合血样为研究对象，研究两个体混合血样的基因座等位基因分型表现。实验材料与方法∶采用Chelex-100法提取DNA，ID试剂盒进行PCR扩增，AB-3130基因自动分析仪电泳，Genemapper3.2软件进行分析。实验结果∶两个体混合血样的基因座等位基因可表现为4个等位基因，3个等位基因，2个等位基因或1个等位基因。随着混合比例差距的增大，量少个体的等位基因峰相对于量多个体等位基因峰越来越低。当混合比例达到1∶10时，量少个体的等位基因峰很低，基本上不影响量多个体的等位基因分型。

混合样本；DNA；STR；等位基因

DNA分析已经成为公安工作中进行个体识别的重要技术，在案件的侦破和审判中发挥重要作用。对于一些特殊检材的分析，比如混合样本的分析就是目前DNA分析的一个难点[1][2]。混合检材是指被测样本来自两个或两个以上个体,常见于阴道拭子、乳头拭子、皮肤咬痕、致伤多人的凶器、指甲等[3]，是检案中经常遇到的检材。对于此类检材，我们常感到十分棘手，难以进行确切的个体识别，严重影响此类案件的侦破和审判[4]。本文主要讨论了两个体混合血样的基因座等位基因分型表现。

一、材料与方法

（一）样本及DNA提取。

采取4名个体静脉血样，标记为1，2，3，4号个体。将1号个体与2号个体血样分别按照1:1，1: 2，1:10，1:50体积混合；3号与4号个体血样按照同样方法进行混合。对所用检测样本均采用Chelex-100法提取DNA[5]，提取的血量为8ul。

（二）PCR扩增。

采用AB公司ID试剂盒进行PCR扩增，扩增体系为10ul。AB公司9700 PCR扩增仪扩增，PCR反应条件为95℃预变性11min，94℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸1min，共进行28个循环，60℃保温60min。

（三）电泳检测及分析。

PCR扩增产物采用AB公司3130基因自动分析仪电泳，Genemapper3.2软件进行分析。电泳体系为：PCR扩增产物1ul，去离子甲酰胺10ul,GS500LIZ内标1.25ul。

二、结果

当按照1：1体积进行混合时，DNA图谱中两名个体的等位基因峰高比较均衡,如图1(1号、2号个体STR分型结果见表1、表2)。当混合体积为1：2时，量少个体等位基因峰高比较明显低于量多个体。随着混合比例的增大，量少个体等位基因峰相对于量多个体等位基因峰越来越低。当混合比例达到1：10时，量少个体等位基因峰很低，基本上不影响量多个体的等位基因分型（如图2）。两个体混合样本等位基因可表现为4个等位基因（如图3），3个等位基因（如图4、5），2个等位基因（如图6）或1个等位基因（如图7）。

表一 1号个体STR分型结果

表二 2号个体STR分型结果

图一 1号与2号个体1：1体积混合血样STR分型图谱

图二 1号与2号个体1：10体积混合血样STR分型图谱

图三 1号与2号个体混合样本D8S1179基因座分型结果

图四 1号与2号个体混合样本TH01基因座分型结果

图五 1号与2号个体混合样本D3S317基因座分型结果

图六 1号与2号个体混合样本D3S1358基因座分型结果

图七 1号与2号个体混合样本TPOX基因座分型为8

三、讨论

混合样本检测是法医DNA分析的难点。尤其是随着混合个体的数量的增加，分析显得尤为困难。本实验探讨了两个体混合样本的STR基因座等位基因分型图谱。两样本混合STR图谱与该两个个体STR等位基因基因型情况密切相关。人体细胞核DNA为二倍体，一名个体STR等位基因最多为两种（杂合子为两个不同的等位基因，纯合子为两个相同的等位基因）。两个体混合样本的单个STR分型可能表现为四种情况：4个等位基因，3个等位基因，2个等位基因，1个等位基因。本次研究的1号与2号个体混合血样DNA分析的D8S1179、D21S11基因座表现为4个等位基因（1号、2号个体STR分型结果见表1、表2）；TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、vWA、D18S51、FGA基因座表现为3个等位基因；D7S820、CSF1PO、D3S1358、D5S818基因座表现为2个等位基因；TPOX基因座表现为1个等位基因。

当混合样本DNA分析基因座表现为4个等位基因时，两名个体均为杂合子，如果我们已知一名个体的分型，容易推断另外一名个体的分型，当混合比例达到1：10时，我们从图谱上能够比较容易区分两名个体的基因座等位基因分型，如本次研究的D8S1179基因座（如图3），1号个体基因型为13-15，2号个体基因型为10-14，从1：10混合血样图谱上我们能够清晰的进行区分。

当混合样本DNA分析基因座表现为3个等位基因时，个体的等位基因组合就比较多，两名个体可能一名为纯合子，一名为杂合子，也可能两名个体均为杂合子，如本次研究的TH01基因座一名个体为纯合子（9-9），一名个体为杂合子（6-7），当混合比例达到1：10时，含量少的个体（9-9）分型峰很低（如图4）。混合样本D13S317基因座分型图谱表现为3个等位基因，两名个体均为纯合子（10-11，11-12），随着混合比例的增加，等位基因10的相对峰高逐渐降低（如图5）。

当混合样本DNA分析基因座表现为2个等位基因时，两名个体可能都为纯合子，可能一个纯合子与一个杂合子，可能两个都为杂合子。如本次研究的D3S1358基因座一名个体为杂合子（15-16）另一名个体为纯合子（16-16），随着混合比例的增加，等位基因15的相对峰高逐渐降低（如图6）。

当混合样本DNA分析基因座表现为1个等位基因时，则两名个体为相同的纯合子，如本次研究的TPOX基因座两名个体均为纯合子（8-8）（如图7）。

混合样本是法医DNA分析的一个难点问题，我们只是对两样本混合的情况进行了等位基因分型的初步研究，如何区分混合样本中各个个体的基因型将是一个长期研究的课题。

[参考文献]：

[1]吕德坚，陆惠玲，陈玉川.混合斑的DNA分型解析[J].法医学杂志，2002，18（3）:185-188.

[2]Bill,P.Gill,J.Curran,T.Clayton,R.Pinchin,M.Healy,J.Buckleton,PENDULUM-a guideline based approach to the interpretation of STR m ixtures,Forensic Sci.Int.148(2004)181-189.

[3][美]布尔特尔.法医DNA分型∶STR遗传标记的生物学,方法学及遗传学[M].侯一平.刘雅诚译，北京∶科学出版社，2007.

[4]T.M.C layton,J.P.W hitaker,R.L.Sparkes,P.Gill,Analysis and intepretation ofm ixed forensic stains using DNA STR profiling,Forensic Sci.Int.91(1998)55-70.

[5]P.S.W alsh,D.A.Metzger,R.Higuchi,Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based from forensicmaterial,Biotechniques10(1991)506-513.

Exp loration on Allelic Classification of Mixed Blood DNA

LONG Bin,LUO Yang,MENG Fang

Target:Research on allelic classification performance of gene locus in two mixed human blood.Materials and Methods:using Chelex-100 to extract DNA,amplifying PCR in ID kit,making analysis by AB-3130 gene electrophoresis automatic analyzer and Genemapper3.2 software.Results:4 or 3 or 2 or 1 alleles can be showed in twomixed blood gene locus.With the increasing ofmixture ratio,the allele peak with less amounts becomes lower and lower than those with more amounts.When mixing proportion reaches 1:10,allele peak is lowest,basically does notaffectallelic classification in large amounts

Mixed Samples;DNA;STR;Allele

D919.2

：A

：1674-5612（2015）01-0051-06

（责任编辑：吴良培）

2014-07-11

龙 兵，(1980-)，男，四川德阳人，四川警察学院刑事科学技术系副教授，研究方向：法医遗传学。