崔 闯，任 清*

响应面法优化黄酒酿造工艺

崔 闯，任 清*

（北京工商大学食品学院，北京 100048）

以小米为原料，在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken响应面法对小米黄酒的酿造工艺进行优化。结果表明：回归方程拟合性好，在酒曲添加量0.9%、糖化时间63 h、糖化温度31 ℃、酵母添加量0.39%、发酵温度32 ℃、发酵时间5 d时为最佳酿造条件。在此最优条件下，验证优化工艺得到最大糖度、最小酸度及最大酒精体积分数分别为17.25%、0.377 1和12.10%，与模型预测值17.26%、0.377 3和12.00%无显著性差异，表明通过响应面法优化的回归方程具有一定的实践指导意义。

小米；黄酒；响应面法；酿造工艺

谷子为五谷之一，属禾本科，狗尾草属，起源于我国，是世界上古老的农产品之一[1]，谷子脱壳后为小米，其具有生育期短、适应性广、价格低廉等优点[2-4]。小米的营养丰富[5]，含有丰富的碳水化合物、蛋白质、氨基酸、脂肪酸、维生素及矿物质等[6]，且各种营养物质比例适宜，是一种良好的营养源[7]，但多年以来人们对小米的食用方法比较单一，对小米的深加工研究也一直没有引起足够的重视[8-17]，因此，为小米资源的深加工开辟新途径具有重要意义。黄酒是我国特有的传统酒种，是世界上最古老的三大酿造酒之一[18]，随着人们物质文化生活水平的日益提高，消费者对黄酒这一产品的要求也不断提高，黄酒的营养价值和口感越来越受到消费者的普遍重视[19]。

本实验以小米作为酿造原料，采用Box-Behnken响应面法得到其制备黄酒的最优酿造条件，旨在为实现小米资源的开发利用及黄酒新产品的开发提供基础研究资料。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

小米：“张杂谷7号”由张家口市农业科学院提供。

酒曲、酵母 湖北安琪生物集团有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

THZ-D台式恒温振荡器 苏州市培英实验设备有限公司；T-6紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；SHP-250型生化培养箱 上海精宏实验设备有限公司；电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；Allegra 64r台式高速冷冻离心机 美国Beckman公司；酒精计 河间市双塔仪表厂。

1.3实验方法

1.3.1小米黄酒酿造工艺流程

1.3.2理化指标测定

还原糖含量的测定：3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色定糖法[20]；酸度的测定[21]：分别从发酵醪的上层、中层、下层3点取样并混合均匀，再取混合之后的样品10 g，放于研钵中研磨成匀浆，之后加入100 mL无CO2的水，搅拌均匀后静置30 min，期间搅拌一次，取上清液用已标定的0.1 mol/L的NaOH溶液进行滴定。酒精体积分数、总糖、总酸、非糖固形物、氨基酸态氮的测定：均参照GB/T 13662—2008《黄酒》[22]中相关指标的方法测定。

1.3.3感官评定方法

从酿造的黄酒中取样并进行感官评价，主要指标为外观、香气、口味和风格四方面。

1.3.4统计分析方法

每个单因素试验在相同的试验条件下重复操作3次，对验证实验结果采用方差分析方法比较结果与预测值之间的显著性差异。

1.4影响小米黄酒糖化工艺的单因素试验

1.4.1加曲量对小米黄酒糖化效果的影响

向蒸熟淋冷后的小米中分别添加0.4%、0.6%、0.8%、1.0%和1.2%的酒曲，搅拌均匀后搭窝，于30 ℃条件下糖化48 h后，取样测定其糖度和酸度。

1.4.2糖化时间对小米黄酒糖化效果的影响

向蒸熟淋冷后的小米中添加0.8%的酒曲，搅拌均匀后搭窝，于30 ℃条件下分别糖化24、36、48、60、72 h后，取样测定其糖度和酸度。

1.4.3糖化温度对小米黄酒糖化效果的影响

向蒸熟淋冷后的小米中添加0.8%的酒曲，搅拌均匀后搭窝，分别于20、25、30、35、40 ℃条件下糖化60 h后，取样测定其糖度和酸度。

1.5响应面法优化小米黄酒糖化工艺

在单因素试验结果的基础上，选择加曲量、糖化时间及糖化温度为响应面优化的考察因素，并以-1、0、1分别代表因素的水平，以糖化结束的黄酒糖度及酸度为响应值，设计三因素三水平的响应面分析试验。

1.6影响小米黄酒发酵工艺的单因素试验

1.6.1酵母添加量对小米黄酒发酵效果的影响

向一定量经过糖化的小米中，分别添加0.18%、0.25%、0.32%、0.39%和0.46%的酵母，搅拌均匀后于35 ℃条件下发酵3 d，确定产酒量并测定酒液的酒精体积分数、总糖及总酸含量。

1.6.2发酵温度对小米黄酒发酵效果的影响

向一定量经过糖化的小米中添加0.39%的酵母搅拌均匀后，分别于29、32、35、38、41 ℃条件下发酵3 d，确定产酒量并测定酒液的酒精体积分数、总糖及总酸含量。

1.6.3发酵时间对小米黄酒发酵效果的影响

向一定量经过糖化的小米中添加0.39%的酵母搅拌均匀后，于32 ℃条件下分别发酵2、3、4、5、6 d，确定产酒量并测定酒液的酒精体积分数、总糖及总酸含量。

1.7响应面法优化小米黄酒发酵工艺

在单因素试验结果的基础上，选择酵母添加量、发酵温度及发酵时间为响应面优化的考察因素，并以-1、0、1分别代表因素的水平，以发酵结束的黄酒酒精体积分数为响应值，设计三因素三水平的响应面分析试验。

2 结果与分析

2.1糖化工艺单因素试验及结果

2.1.1加曲量对小米黄酒糖化效果的影响

图1 酒曲添加量对糖化效果的影响Fig.1 Effect of koji concentration on saccharification efficiency

由图1可知，随着酒曲添加量的增加，糖度逐渐增加，当酒曲添加量为0.6%～1.0%时，糖度变化不大，酸度则呈现先升高再降低，最后又升高的过程。黄酒属于开放式发酵，发酵过程中来自环境中的微生物也会进入发酵醪中参与发酵，如果糖化速率过快，产酸菌就会大量繁殖，导致酸度升高[23]。在糖度变化不大的条件下考察酸度，酸度高则会影响黄酒品质，故加曲量存在最适用量，综合考虑，加曲量取0.8%较合适。

2.1.2糖化时间对小米黄酒糖化效果的影响

由图2可知，随着糖化时间的延长，糖度不断增加，在糖化时间为60 h时，糖度达到最大值，酸度随着糖化时间的延长呈现上升的趋势。糖化时间短，小米含有的淀粉未得到充分水解，随着糖化时间的延长，小米中的淀粉被不断水解转化为糖，糖度不断增加，当糖化时间超过60 h时，糖度呈下降趋势，酸度呈上升趋势，说明糖化已进行的比较彻底，产酸菌的比重增加。综合考虑，糖化时间为60 h较合适。

图2 糖化时间对糖化效果的影响Fig.2 Effect of saccharification time on saccharification efficiency

2.1.3糖化温度对小米黄酒糖化效果的影响

图3 糖化温度对糖化效果的影响Fig.3 Effect of saccharification temperature on saccharification efficiency

由图3可知，一开始糖度随着温度的升高而增加，当温度为30 ℃时达到最大值，之后则随着温度的升高呈下降趋势，酸度则随着温度的升高呈现先降低后升高的趋势。分析原因可知，温度低时糖化速率慢，杂菌生长竞争力强，导致样品酸度很高；随着温度的升高，酒曲对淀粉水解程度增加，糖度升高，酸度降低；当温度超过酒曲的最适温度时，酒曲的活性降低，从而使糖化效果变差，嗜热产酸菌活力更强，导致样品酸度上升，最终确定最适糖化温度为30 ℃，这与现有相关研究结论一致[24]。

2.2响应面优化糖化工艺试验结果及分析

响应面法优化小米黄酒糖化工艺的试验结果见表1。通过Design Expert 8.0.6.1软件对试验进行回归分析，预测小米黄酒糖化的最优工艺参数，方差分析结果见表2、3。

对表1中的试验数据进行多元回归拟合后，分别得到各因素水平对黄酒糖化糖度（Y1）与黄酒糖化酸度（Y2）影响的二次多项回归模型：

分别对两种模型采用二次型进行变异分析，方程的相关系数分别为R12=0.992 5，R22=0.920 1，说明两种模型拟合程度均较好，可以用于小米黄酒糖化工艺实验的预测。

表1 Box-Behnken试验设计方案及结果Table 1 Box-Behnken design with experimental values of sugar content and aciddiittyy

表2 以糖度为响应值回归模型的方差分析Table 2 Analysis of variance of sugar content

由表2、3可知，方程（1）中除AB与A2项无显著影响外，其他项对糖度的影响达到极显著水平（P＜0.01）；方程（2）中C项和C2项对酸度的影响达到极显著水平（P＜0.01）。另外，在选定的实验范围内，各因素对试验结果的重要性与F值的大小呈正比，各因素对糖度及酸度的影响大小顺序均为糖化温度＞糖化时间＞加曲量。

表3 以酸度为响应值回归模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of acidity

2.3小米黄酒糖化工艺条件验证

采用Design Expert 8.0.6.1统计软件联合求解模型方程（1）和（2），得出小米黄酒糖化的最优工艺参数：酒曲添加量0.9%、糖化时间63.1 h、糖化温度31.67 ℃。为了检验响应面法所得结果的可靠性，采用上述优化参数进行小米黄酒的糖化。考虑到实际操作的便利，将小米黄酒糖化工艺参数优化为酒曲添加量0.9%、糖化时间63 h、糖化温度31 ℃，根据此最优参数进行小米黄酒的糖化（n=3）。结果表明，平均糖度为17.25%，预测值为17.26%，经显著性方差分析，P=0.373 9＞0.05，可以认为实验结果与预测值之间无显著性差异，平均酸度为0.377 1，预测值为0.377 3，经显著性方差分析，P=0.101 2＞0.05，可以认为实验结果与预测值之间无显著性差异，表明该模型可以较好地反映出小米黄酒糖化工艺条件，采用Box-Behnken响应面法优化小米黄酒糖化工艺结果可靠。

2.4发酵工艺单因素试验及结果

2.4.1酵母添加量对小米黄酒发酵效果的影响

图4 酵母添加量对发酵效果的影响Fig.4 Effect of yeast concentration on fermentation efficiency

如图4所示，随着酵母添加量的增大，产酒量呈现先升高后缓慢降低的趋势，酒精体积分数逐渐升高，并在添加量0.39%时达到最大，而后逐渐下降，其原因可能是较高添加量的酵母菌完成自身繁殖需要消耗大量的糖类物质，致使发酵液中转化为酒精的糖度降低，从而使酒精体积分数偏低，因此酵母添加量为0.39%较合适，表4显示各组酒液的总酸及总糖值均符合黄酒标准。

表4 酵母添加量对小米黄酒指标的影响Table 4 Effect of yeast concentration on sensory and chemical indicators of millet yellow wine

2.4.2发酵温度对小米黄酒发酵效果的影响

图5 发酵温度对发酵效果的影响Fig.5 Effect of fermentation temperature on fermentation efficiency

由图5可知，当发酵温度为29～35 ℃时酒样的酒精体积分数差别不大，当发酵温度超过35 ℃时酒精体积分数降低。这是因为酵母的活性存在最适温度，温度过高或过低都会抑制酵母的活性[25]，进而影响发酵效果，结合出酒量考虑发酵温度为32 ℃较合适，表5显示各组酒液的总酸及总糖均符合黄酒标准。

表5 发酵温度对小米黄酒指标的影响Table 5 Effect of fermentation temperature on sensory and chemical indicators of millet yellow wine

2.4.3发酵时间对小米黄酒发酵效果的影响

图6 发酵时间对发酵效果的影响Fig.6 Effect of fermentation time on fermentation efficiency

由图6可知，一开始随着发酵时间的延长，酒精体积分数迅速增加，当发酵时间超过4 d之后酒精体积分数的增加趋于平缓，可能是因为糖化液中大部分的还原糖已被酵母转化为酒精[26]，产酒量则在发酵第5天时达到最大，从生产上考虑，选择发酵5 d最为合适，表6显示各组酒液的总酸及总糖均符合黄酒标准。

表6 发酵时间对小米黄酒发酵指标的影响Table 6 Effect of fermentation time on sensory and chemical indicators of millet yellow wine

2.5 响应面优化发酵工艺试验结果及分析

表7 小米黄酒发酵工艺优化试验设计及结果Table 7 Response surface design with experimental values of alcohol content

对表7中试验数据进行多元回归拟合后，得到各因素水平对黄酒酒精体积分数（Y）影响的二次多项回归模型：

对该模型采用二次型进行变异分析，方程的相关系数R2=0.901 2，说明该模型拟合程度较好，可以用于小米黄酒发酵工艺实验的预测。

响应面法优化小米黄酒发酵工艺的试验结果见表7。通过Design Expert 8.0.6.1软件对试验结果进行回归分析，预测小米黄酒发酵的最优工艺参数，方差分析结果见表8。

表8 以酒精体积分数为响应面结果的方差分析Table 8 Analysis of variance of alcohol content

由表8可知，方程（3）中A2项对酒精体积分数的影响达到显著水平（P＜0.05），B2项和C2项对酒精体积分数的影响达到极显著水平（P＜0.01）。另外，在选定的实验范围内，各因素对试验结果的重要性与F值的大小呈正比，从表8中可以推断出各因素对酒精体积分数的影响大小顺序是：发酵时间＞发酵温度＞酵母添加量。

2.6小米黄酒发酵工艺条件验证

通过Design Expert 8.0.6.1统计软件求解模型方程（3），得出小米黄酒发酵的最优工艺条件：酵母添加量0.39%、发酵时间4.85 d、发酵温度32.36 ℃。为了检验响应面法所得结果的可靠性，采用上述优化条件进行小米黄酒的发酵，考虑到实际操作的便利，将小米黄酒发酵工艺参数优化为酵母添加量0.39%、发酵时间5 d、发酵温度32 ℃，根据此最优参数进行小米黄酒糖化（n=3）。结果显示，平均酒精体积分数为12.10%，预测值为12.00%，经显著性方差分析，P=0.287 9＞0.05，可以认为实验结果与预测值之间无显著性差异，说明该模型可以较好地反映出小米黄酒发酵工艺条件，采用Box-Behnken响应面法优化小米黄酒发酵工艺的结果可靠。

3 结 论

本实验在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken响应面分析法对小米黄酒酿造工艺进行了优化，并对试验结果进行了数学模拟和预测。最终确定了小米黄酒酿造的最优参数：酒曲添加量0.9%、糖化时间63 h、糖化温度31 ℃、酵母添加量0.39%、发酵时间5 d、发酵温度32 ℃。各因素对响应值均有极显著影响，采用该条件进行验证实验，得到的平均糖度、酸度和酒精体积分数分别为17.25%、0.377 1和12.10%，经方差分析，与预测值均无显著性差异，综合回归模型分析及验证实验，采用响应面法对小米黄酒酿造工艺进行优化方法可行，得出的最优酿造工艺具有一定的实际应用价值，以小米为原料酿造黄酒开发前景广阔。

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Process Optimization for the Production of Chinese Yellow Wine by Response Surface Methodology

CUI Chuang, REN Qing*
(School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

In this study, millet was used to produce yellow wine by saccharification and subsequent fermentation. The production process was optimized using combination of single factor method and response surface methodology. A well-fitted regression model equation was established using Box-Behnken design. The results showed that the optimal conditions for producing Chinese yellow wine were found to be saccharification at 31℃for 63 h after addition of 0.9%koji followed by fermentation at 32℃for 5 d after inoculation of 0.39%yeast. Under these conditions, the maximum sugar content, the minimum acidity and the maximum alcohol content (by volume) of millet yellow wine were observed to be 17.25%, 0.377 1 and 12.10%, agreeing with the predicted values (17.26%, 0.377 3 and 12.00%). Key words: millet; yellow wine; response surface methodology; production process

TS262.4

1002-6630（2015）11-0134-06

10.7506/spkx1002-6630-201511026

2014-07-03

公益性行业（农业）科研专项（201303069-07）

崔闯（1990—），女，硕士，研究方向为食品生物技术。E-mail：cc19901011@163.com

*通信作者：任清（1969—），男，副教授，博士，研究方向为生物活性成分的分离提取及功能。E-mail：renqing@th.btbu.edu.cn