白敏，李崎，邵艳姣，黄元华，李大力，马燕琳1. 贵阳中医学院研究生院，贵阳 55000；. 海南医学院附属医院，海南省人类生殖与遗传重点实验室，海口 57010；. 华东师范大学生命科学学院，上海 0041

利用CRISPR/Cas9技术构建定点突变小鼠品系

白敏1,2，李崎2，邵艳姣3，黄元华2，李大力3，马燕琳2
1. 贵阳中医学院研究生院，贵阳 550002；2. 海南医学院附属医院，海南省人类生殖与遗传重点实验室，海口 570102；3. 华东师范大学生命科学学院，上海 200241

CRISPR/Cas9技术是新近发展起来的对细胞和动物模型进行基因编辑的重要方法。本文利用DNA双链断裂(Double-strand breaks, DSBs)引起的同源重组(Homologous recombination, HR)依赖与非依赖的修复机制，建立基于 CRISPR/Cas9核酸酶技术构建定点突变小鼠品系的技术体系。针对赖氨酸特异脱甲基化酶 2b(Lysine (K)-specific demethylase 2b, Kdm2b)酶活关键位点对应的基因组DNA序列设计单一导向RNA(Single-guide RNA, sgRNA)，通过与Cas9 mRNA共显微注射，分别得到Kdm2b基因发生移码突变的基因失活品系及关键位点氨基酸缺失的酶活突变型小鼠品系。此外，利用HR介导的修复机理，将黄素单加氧酶 3(Flavin containing monooxygenases3, Fmo3)基因的sgRNA序列及对应的点突变单链寡脱氧核苷(Single strand oligonucleotides, ssODN)修复模板共注射到小鼠受精卵雄原核。对F0小鼠基因测序分析显示，成功构建了Fmo3基因移码突变的基因敲除和单碱基定点突变的基因敲入小鼠，这些突变能够稳定遗传给子代。本研究利用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组依赖与非依赖两种DNA损伤修复方式，成功构建了特定位点突变的小鼠品系。

基因敲除；基因敲入；酶活突变；同源重组

基因修饰动物模型是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具[1]。……