周 慧，曾品涛(山西医科大学细胞生理学省部共建教育部重点实验室，太原 03000;扬子江药业集团四川海蓉药业有限公司;通讯作者，E-mail:zhouhui_984@6．com)

洛伐他汀(lovastatin)是目前临床上重要的降血脂药物，对原发性高胆固醇血症十分有效，是由真菌产生的一种甲基羟二戊酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，能通过抑制HMG-CoA还原酶，减少胆固醇的合成，并上调肝细胞表面低密度脂蛋白受体的表达，加速血液中低密度脂蛋白胆固醇向肝脏的转移与代谢清除，从而达到降低血脂的功效［1］。洛伐他汀的提取一般采用溶媒萃取法［2-4］，但此法耗用大量溶媒，成本较高，经多次转提，收率较低。作者采用超临界CO2流体对洛伐他汀进行提取，探讨超临界CO2萃取的最佳条件及工业应用前景。

1 材料与方法

1．1 仪器与试药

TC-SPE-50-0．5-210S 型0．5 L 超临界萃取仪(沈阳天诚超临界萃取有限公司);Ultrospec 4300TM紫外分光光度计(美国GE He2althcare);Waters高效液相色谱仪(Waters1525二元泵，Waters2487紫外检测器);Breeze液相色谱工作站。菌渣(重庆大新药业股份有限公司);洛伐他汀(上海信然生物技术有限公司，HPLC归一化法测定含量为99．8%);CO2食品级(99．5%，重庆朝阳气体厂);其他试剂均为市售分析纯。

1．2 提取方法及实验设计

称取100．0 g经干燥的红曲霉发酵液菌渣9份，置超临界萃取釜中，加入适量夹带剂，按程序升温加压，进行动态萃取，CO2流量为4．6 L/h，解析压力为7 MPa，定量泵入夹带剂。萃取结束后从解析釜收集产品，减压回收乙醇，得到洛伐他汀粗品［5］。

本研究通过单因素实验，考察了萃取压力(A)、萃取温度(B)、夹带剂用量(C)、萃取时间(D)对洛伐他汀萃取率的影响;通过正交实验(因素水平见表1)优化超临界提取洛伐他汀的最佳工艺条件，并比较了各因素对萃取效果的影响。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels

1．3 洛伐他汀产品检测

用Waters高效液相色谱绘制洛伐他汀标品标准曲线，线性范围为 0．248-1．24 μg，色谱条件为:Shimadzu C18(150 mm ×4．6 mm，5 μm);流动相为乙腈 -0．2%H3PO4溶液(60∶40);流速为 1．0 ml/min;检测波长238 nm;柱温为室温。标线方程为:Y=0．800 ×106X+2．657 6 ×105(r=0．999 7)［6-8］。

准确称取80．3 mg洛伐他汀粗品，用甲醇溶解定容至50 ml，0．45 μm 滤膜过滤，用高效液相色谱进行检测，计算产品纯度，并将产品质量换算为纯的洛伐他汀质量计算萃取率。

2 结果

2．1 单因素实验

萃取压力通常是影响萃取率的一个重要因素［9，10］，作者通过单因素实验测定压力对萃取率的影响，选用95%乙醇做夹带剂，萃取温度55℃，分别在 15，20，25，35，40 MPa 下进行萃取 100 min，结果见图1，可以看出超临界CO2萃取洛伐他汀的最佳压力为25 MPa。

图1 萃取压力对洛伐他汀萃取率的影响Figure 1 Effect of extraction pressure on the extraction rate

作者同样采用单因素试验考察萃取温度［9，10］对洛伐他汀萃取率的影响，选用95%乙醇做夹带剂，萃取压力25 MPa进行萃取100 min，，萃取温度分别为40，45，50，55，60，65 ℃时的萃取率，结果见图 2，可以看出最佳温度为55℃。

图2 萃取温度对洛伐他汀萃取率的影响Figure 2 Effect of extraction temperature on the extraction rate

作者考察了95%乙醇做夹带剂，萃取压力25 MPa，萃取温度55℃条件下，萃取时间分别为60，80，100，120，140 min 时洛伐他汀的萃取率。从图3可以看出，100 min以后萃取率基本不增长，故选择萃取100 min。

考虑到药品原料“绿色环保”需求，本研究选用95%乙醇作夹带剂，用量分别为菌渣的500，1 000，1 500，2 000，2 500，3 000 ml/kg。其他因素条件为:萃取压力25 MPa，萃取温度55℃，萃取100 min。实验结果见图4。从结果看出，夹带剂用量低于2 000 ml/kg时，随着夹带剂用量的增大，萃取率升高;当夹带剂用量超过2 000 ml/kg萃取率开始下降，所以我们选择夹带剂用量为2 000 ml/kg。

图3 萃取时间对洛伐他汀萃取率的影响Figure 3 Effect of extraction time on the extraction rate

图4 夹带剂用量对洛伐他汀萃取率的影响Figure 4 Effect of entrainer level on the extraction rate

2．2 正交试验

根据文献［11，12］方法及单因素试验结果，采用L9(34)正交表进行实验，试验结果见表2。分析得到超临界CO2萃取洛伐他汀的最佳工艺条件为A2B3C2D2，由于在正交实验中没有包含此工艺条件，故对其进行验证实验(见表3)，并同正交实验中表现最佳的“实验6”结果进行比较。本工艺条件下洛伐他汀萃取率可高达97．17%，高于“实验6”的萃取率95．53%。因此，超临界CO2提取洛伐他汀的最佳工艺条件为:萃取压力25 MPa，萃取温度55℃，夹带剂用量为2 000 ml/kg，萃取时间100 min。

用极差分析法对正交实验结果进行分析，由极差值可知，影响提取物中洛伐他汀含量的因素，逐次顺序为:萃取压力＞萃取温度＞萃取时间＞夹带剂用量。

用方差分析法对正交实验结果进行分析(见表4)，根据F分布表判断各因素对实验效果影响的程度:萃取压力(A)对提取物中洛伐他汀的含量有比较显著影响，萃取温度(B)、夹带剂用量(C)、萃取时间(D)影响不显著。

表2 正交试验结果Table 2 The results of the orthogonal test

表3 验证试验结果 (n=3)Table 3 The results of proof test (n=3)

表4 洛伐他汀含量方差分析Table 4 Variance analysis of the lovastatin content

3 讨论

从影响洛伐他汀萃取率各因素的单因素试验结果我们可以看出，萃取压力增加，可以提高超临界流体的溶解能力，提高提取物产量，但过高的萃取压力却会影响超临界流体的溶解选择性，导致更多的杂质与目标提取物竞争溶出，反而降低了目标提取物的产量和纯度，萃取压力≥25 MPa时，洛伐他汀的萃取率反而下降;萃取过程中，随着温度的升高，洛伐他汀的溶解度增大，萃取率增加，当温度达55℃以上时，超临界CO2流体的密度减小、溶解性能下降，萃取率下降;萃取过程随着时间的延长，洛伐他汀的萃取率增加，当萃取100 min以后萃取率基本保持不变，综合考虑经济、节能等因素，我们选择100 min为最佳提取时间;本研究选用95%乙醇作夹带剂，夹带剂用量少时，萃取率较低，可能是因为夹带剂用量少，不能将洛伐他汀充分溶解其中;夹带剂用量大时，溶解了其他成分，杂质较多，萃取率降低，故我们选择夹带剂用量为2 000 ml/kg。

根据正交试验结果以及验证试验的对比，我们确定超临界CO2萃取洛伐他汀的最佳工艺条件为:萃取压力25 MPa，萃取温度50℃，夹带剂用量为2 000 ml/kg，萃取时间100 min，萃取率可达97．17%。各工艺参数对提取效果的影响排序为:萃取压力＞萃取温度＞萃取时间＞夹带剂用量。

超临界CO2萃取洛伐他汀萃取率高达97．17%，远高于传统溶媒提取法，CO2可重复使用，不存在有机溶剂残留问题，无污染，具有环境友好、生产周期短、生产环境安全、成本低的优点，适应工业化生产的需求，有广阔的工业应用前景。

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