肖志红，吴 红 ，李昌珠 ，张爱华，刘汝宽 ，吴晓芙

（1.中南林业科技大学，湖南 长沙410004；2. 湖南省林业科学院，湖南 长沙410004）

固定化假丝酵母脂肪酶对光皮树油的吸附性能

肖志红1,2，吴 红2，李昌珠2，张爱华2，刘汝宽2，吴晓芙1

（1.中南林业科技大学，湖南 长沙410004；2. 湖南省林业科学院，湖南 长沙410004）

通过TEM、比表面孔分布测定仪等对含环氧基团的聚合物载体(GHD)性能进行了表征。以GHD为载体，制备了固定化假丝酵母脂肪酶。研究了光皮树油在固定化假丝酵母脂肪酶（I-CRL）上的吸附行为，从吸附平衡和吸附动力学角度探讨了吸附机理。结果表明，光皮树油在I-CRL上的等温吸附过程符合Langmiur方程，为单分子层吸附。实验数据能很好的拟合二级动力学吸附方程，当采用聚合物GHD(40)为载体，初始光皮树油浓度（Ce）为210 mg/g，在温度为325 K，330 K，335 K时，由Arrhenius公式求得的表观活化能Ea为30.44 kJ/mol，吸附过程为吸热反应。

光皮树油；固定化假丝酵母脂肪酶；多孔高分子微球；吸附平衡；吸附动力学

脂肪酶在动、植物和微生物体内普遍存在，是一种特殊的酰基水解酶[1]，可催化脂水解、缩合、酯交换、脂合成、氨解等[2-4]反应，但游离脂肪酶的缺点也是显而易见的，如稳定性差，使用效率低，适应反应介质能力弱等。酶的固定化方法有多种，其中共价键结合法具有酶与载体结合较为牢固，酶不易脱落及稳定性高等优点。含有环氧基团的高分子聚合物，表面的环氧基团可以在温和的条件下与酶分子的氨基共价结合[5-6]，使酶分子被固定于聚合物载体表面。借助环氧基团实现酶的固定化，不仅条件温和，酶分子不易脱落，载体不必预活化，同时，还可降低固定化过程对酶活力的损失，因而十分适合于工业固定化酶的生产。

在固定化脂肪酶制备生物柴油的过程中，在众多酶活力发挥效用的因素中，固定化酶对底物的吸附能力是关键因素之一[7]。固定化酶与底物之间的作用力太大，不利于酯交换后底物的解吸附，作用力太小，又增加了底物与固定化酶接触的传质阻力。目前对固定化酶与底物相互作用的研究较少。本文制备了一系列不同表面性能的载体，将制备的载体固定化假丝酵母脂肪酶。研究了光皮树油在固定化假丝酵母脂肪酶上的吸附行为，考察了载体和温度等因素对光皮树油吸附量的影响，并从吸附平衡和吸附动力学角度探讨了光皮树油在固定化脂肪酶上的吸附机理[8-10]。

1 实验部分

1.1 化学试剂

假丝酵母脂肪酶（sigma, L1754 - Type VII），光皮树油（自制），甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA，≥95%）、甲基丙烯酸羟乙酯（HEMA，≥98%）、二乙烯基苯（DVB，≥98%），NaOH（分析纯），甲醇（分析纯），甲醇（色谱纯，ACROS）。以上试剂除非特别特别说明，均购自上海国药。

1.2 试验仪器

透射电镜(日本日立，Hitachi-600)；全自动物理吸附微孔分析仪（Micromeritics, ASAP 2010）；紫外可见分光光度计（SPECRORD，210 plus）；索氏抽提器（上海本昂，SXT-06）；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；电子天平(瑞士Mettler Toledo)； GC-2014气相色谱仪 (日本，岛津仪器有限公司)。

1.3 多孔高分子微球载体的制备

多孔高分子微球载体的制备采用悬浮聚合法，在100 mL三角烧瓶中加入50 mL含2 %的可溶性淀粉的饱和氯化钠溶液作为连续相，以甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）、甲基丙烯酸羟乙酯（HEMA）、二乙烯基苯（DVB）和正庚烷为分散相。以物质的量之比HEMA∶H∶（GMA + DVB）=3∶1∶6。将上述悬浮液倒入100 mL三口烧瓶中，三口烧瓶固定在恒温水浴锅中，分别接好机械搅拌器、冷凝管和氮气导气管，通入氮气，升温，待温度升高至70 ℃，加入引发剂过氧化二苯甲酰，氮气氛下开启搅拌至450 r/min，反应3 h。离心分离。先用70 ℃蒸馏水冲洗几次，之后用丙酮抽提12 h，抽提物用NaOH/甲醇溶液醇解12 h，最后用去离子水洗至中性，真空下50 ℃干燥，得到多孔微球GHD。共聚物用GHD(w)表示，其中w为交联剂DVB所占的比例。除非特别标明，上述所有药品都是分析纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司。

1.4 聚合物的性能测试

多孔高分子微球环氧值测定采用GB 1677-8，共聚载体吸水率的测定采用常规水浸泡溶胀法，吸水率α=[(w-wo)/wo]×100%，式中wo, w分别代表共聚载体溶胀前后的质量。全自动物理吸附微孔分析仪（Micromeritics, ASAP 2010）测定比表面积及孔径分布仪，比表面积采用BET法。透射电镜(日本日立，Hitachi-600)测聚合物的微观结构。

1.5 固定化酶的制备

将1.0 g载体加入到20mL质量分数为6 %的pH值为7.2的假丝酵母脂肪酶（sigma, L1754-Type VII）溶液中，在震荡箱中37 ℃反应7 h，离心分离。固定化酶用磷酸缓冲溶液洗3次后水洗3次，常温下真空干燥，制得固定化脂肪酶。酶活力测定参照文献[8]进行，用紫外-可见分光光度计（SPECRORD，210 PLUS）测定未固定化的蛋白质的吸光度，从而确定固定到载体上的脂肪酶的量。

1.6 吸附平衡实验

取一定量的光皮树油溶解于200 mL叔丁醇中，加入5 g固定化酶聚合物，置于恒温振荡器中150 r/min吸附24 h后，测定光皮树油的吸附量，采用光皮树油甲酯化后气相色谱FID检测器未被吸附的光皮树油的含量。由吸附前后的光皮树油的浓度差计算吸附量。

1.7 吸附动力学实验

取不同量的光皮树油溶解于200 ml叔丁醇中，加入5 g固定化酶聚合物，将装有混合体系的具塞锥形瓶置于震荡箱中反应24 h，震荡速度150 r/min，温度设定为（25, 30, 35或40℃）。反应中每隔2 h移取1 mL反应液用0.22 μm滤膜过滤，测定光皮树油的吸附量，采用光皮树油甲酯化后气相色谱FID检测器未被吸附的光皮树油的含量。通过计算可得出光皮树油在GHD表面的吸附量随时间的变化。

式（1）中：qt为时间t时光皮树油的吸附量；C0为初始光皮树油浓度；Ct为光皮树油未被吸附量；V为溶液的体积；m为固定化酶的质量。

2 结果与讨论

2.1 TEM分析

图1中是GHD(40)高分子微球载体通过饿酸染色，干透后常温切片的透射电镜照片，粒子的直径为4 μm左右，粒子直径分布较为均一。制备的高分子微球载体适合通过离心的方法进行固液分离，足够大的比表面积也有利于脂肪酶的分散，从而增加脂肪酶与光皮树油的接触面积。照片显示高分子多孔微球载体的表面具有多孔结构。

图1 多孔高分子微球的透射电镜照片Fig. 1 TEM micrograph of porous polymer micro-sphere

2.2 聚合物载体性能分析

固定HEMA和致孔剂正庚烷的比例，通过改变GMA和作为交联剂的DVB的比例，得到了不同表面结构和孔结构的高分子微球载体，表1中可以看出，交联剂含量增加，在叔丁醇中的溶胀性能、环氧值和孔径都减小，比表面积增大，在给酶量为200 mg·g-1的条件下，吸附量依次减小，对应的酶活也相应减小。

表1 聚合物载体的性能Table 1 Characters of polymer carriers

2.3 光皮树油浓度的影响

图2是不同浓度光皮树油在固定化假丝酵母脂肪酶上的吸附量，在温度42 ℃，初始光皮树油浓度为 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 mg·g-1的叔丁醇溶液中吸附24 h的平衡吸附线。从图2中可以看出，在相同的光皮树油浓度下，达到吸附平衡时，以GHD(40)为载体的固定化酶吸附的光皮树油最多，以GHD(20)为载体的固定化酶吸附的光皮树油最少，这要归结于载体的比表面积的影响，也可能是载体上酶量不同引起的。

图2 不同浓度光皮树油在固定化CRL上的吸附平衡Fig.2 Equilibrium adsorption of S. wilsoniana oil onto immoblized CRL

将吸附等温线用Langmuir 方程拟合，Langmuir 方程式能很好的描述单分子层吸附，拟合结果见表2和表3。

表2 载体对光皮树油的Langmuir吸附平衡常数Table 2 Langmuir isotherm constants of carriers

Langmuir 方程式为

式（2）中：Ce为吸附平衡时光皮树油的浓度；qe为吸附平衡时光皮树油的吸附量；Q为饱和吸附量；b为吸附系数，其大小与吸附剂、吸附质的性质有关，b越大，表明吸附能力越强以Ce/qe对Ce作图，得到图3所示的直线，通过直线的斜率和截距可以求得Q和b。

由表2和图3可以看出，拟合的Langmuir方程具有良好的线性关系，其相关系数均大于0.99，表明光皮树油在固定化CRL上的吸附是单分子层吸附。GHD(40)为载体的固定化假丝酵母脂肪酶达到吸附平衡时吸附的光皮树油最多，而GHD(20)的速度最快，但是最终达到吸附平衡时吸附的光皮树油最少。因而通过调节不同的载体组成，可以实现固定化假丝酵母脂肪酶吸附光皮树油的最佳的吸附条件，使光皮树油转化生物柴油的速度最快。

图3 固定化酶载体对光皮树油的Langmuir吸附平衡线Fig.3 Langmuir isotherms for different GHD to S. wilsoniana oil

2.4 温度对脂肪酶吸附量的影响

图4 是以GHD(40)为载体的固定化假丝酵母脂肪酶，在初始光皮树油浓度为210 mg·g-1时，325 K，330 K，335 K时固定化CRL吸附光皮树油的量与时间的关系曲线。从图4中可以看出，吸附7 h后，不同温度下光皮树油在固定化酶上均达到吸附平衡，且随着温度升高，光皮树油的平衡吸附量增加。这说明温度升高有利于光皮树油在固定化CRL上的吸附，光皮树油的吸附过程是吸热反应。

图4 温度对光皮树油吸附量的影响Fig.4 Effects of temperature on adsorption capacity for S. wilsoniana oil

2.5 动力学二级吸附方程为

式(3)中：qe和q分别为吸附平衡时和t时的脂肪酶的吸附量，k为二级吸附速率常数。用实验数据拟合准二级吸附速率方程得到qe和动力学常数k的值见表3，系数达到0.999以上，表明光皮树油在固定化CRL上的吸附能够很好的拟合动力学二级吸附方程。光皮树油初始浓度为210 mg·g-1时，温度为325K，330K，335K时（t/q）-t的关系曲线，由直线的截距和斜率可以得到k和qe。

表3 光皮树油在固定化假丝酵母脂肪酶上吸附的准二级吸附动力学参数Table 3 Pseudo-second-order adsorption kinetic parameters for S. wilsoniana oil on immobilized CRL

图5 光皮树油在固定化假丝酵母脂肪上吸附的准二级动力学曲线Fig.5 Pseudo-second-order kinetic plots of S. wilsoniana oil on immobilized CRL

2.6 表观活化能

表观活化能可由Arrhenius公式求得：

式（4）中A为指前因子，Ea为活化能，k2为动力学常数。R是气体常数，T是溶液的温度。lnk2对T作图得一直线，如图6所示，由直线的斜率可以得到固定化CRL吸附光皮树油的表观活化能Ea为 30.44 kJ·mol-1。为吸热反应。

3 结 论

图6 固定化假丝酵母脂肪酶吸附光皮树油的Arrhenius曲线Fig.6 Arrhenius curve for adsorption of S. wilsoniana oil on immobilized CRL

通过悬浮聚合法制备了多孔高分子微球载体GHD，并用制备的三种不同的聚合物载体对假丝酵母脂肪酶进行了固定化。在叔丁醇中，以GHD(40)为载体的固定化假丝酵母脂肪酶对光皮树油的吸附量越多，以GHD(20)为载体的固定化假丝酵母脂肪酶对光皮树油的吸附速度最快，而GHD(30)吸附量和吸附速度居中，表明可以调节载体的性质来控制吸附速度和吸附量。固定化假丝酵母脂肪酶吸附光皮树油的吸附等温线能够很好的拟合Langmiur方程，相关系数大于0.99，表明该吸附过程可以用 Langmuir 方程很好的描述,表明光皮树油在GHD载体上的吸附主要是单分子层吸附。考察了固定化酶载体和温度对光皮树油吸附量的影响，实验数据能够很好的拟合动力学二级吸附方程，相关系数大于0.999。通过准二级动力学吸附速率常数k关联Arrhenius方程，得到吸附活化能为30.44 kJ·mol-1，光皮树油在固定化假丝酵母脂肪酶上的的吸附过程为吸热反应。

[1] Tianwei Tan, Jike Lu, Kaili Nie, et al. Biodiesel production with immobilized lipase: A review[J]. Biotechnology Advances, 2010,28: 628-634.

[2] Magario I, Ma X, Neumann A, et al. Non-porous magnetic micro-particles: Comparison to porous enzyme carriers for a diffusion rate-controlled enzymatic conversion[J]. Journal of Biotechnology, 2008, 134:72-78.

[3] Pamela Torres, Dolores Reyes-Duarte, Nieves López-Cortés,et al. Acetylation of vitamin E by Candida antarctica lipase B immobilized on different carriers[J]. Process Biochemistry, 2008,43 :5-153.

[4] Kebba Sabally, Salwa Karboune[J]. J Biology, 2006, 127:167.

[5] 吴东亮, 赵巧玲, 郭杨龙.含环氧基团的聚合物载体合成方法的改进及其固定化青霉素酰化酶[J]. 催化学报,2010,31(5):586.

[6] 张媛媛,刘均洪,夏亚穆.吸附-聚合物修饰组合固定化Candida antarctica 脂肪酶研究[J]. 高校化学工程学报，2010,24(2):252-257.

[7] 宋锡瑾，宣 锋，王 杰，等。有机相中刻录脂肪酶聚合物对配体的吸附[J].化工学报，2007, 58:1244-1247.

[8] Xuan Feng. The study on immobilization of lipase conformation induced by double substrates and adsorption characteristics of ligand[D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2007.

[9] 李昌珠, 张爱华, 肖志红, 等. 用碱性离子液体催化光皮树果实油制备生物柴油[J]. 中南林业科技大学学报, 2011,31(3):38-43.

[10] 申爱荣, 谭著明, 蒋丽娟, 等. 不同提油方法对制取光皮树油的影响[J]. 中南林业科技大学学报, 2010, 30(11): 129-135.

Adsorption kinetics of immoblized candida lipase to Swida wilsoniana oil

XIAO Zhi-hong1,2, WU Hong2, LI Chang-zhu2, ZHANG Ai-hua2, LIU Ru-kuan2, WU Xiao-fu1
(1. Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China;2.Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, Hunan, China)

A polymeric carrier (GHD) supported with epoxy groups was characterized by TEM and Micromeritics ASAP 2010(a kind of specif i c surface pore distribution analyzer). The immobilized candida lipase (I-CRL) was prepared with GHD as the carrier, further the adsorption performance of Swida wilsoniana oil on I-CRL was studied, and the adsorption mechanisms were investigated from the angles of adsorption equilibrium and kinetic. The results show that the isothermal adsorption of S. wilsoniana oil on I-CRL well agreed with that of Langmiur isothermal model, indicating that the adsorption of S. wilsoniana oil oil on I-CRL was a monolayer adsorption.The experimental data fi tted well to the second-order kinetic model in the case that GHD (40) as carrier and the initial Cewas 210 mg/g.At the meantime, the apparent activation energy (Ea= 30.44 kJ/mol) can be calculated based on Arrhenius equation by the data obtained at 325 K, 330 K and 335 K. The adsorption of Swida wilsoniana oil on I-CRL was proved to be an endothermic reaction.

Swida wilsoniana oil; immobilized candida lipase; porous polymer micro-sphere; adsorption equilibrium; adsorption kinetics

S727.32

A

1673-923X(2014)02-0117-05

2013-05-16

国家林业局林业公益性行业科研专项（201004071）；国家科技支撑计划（2011BAD22B04）；湖南省自然科学基金（14JJ2141）

肖志红（1974-），男，副研究员，主要从事生物质能研究；E-mail：xzhh1015@163.com

[本文编校：吴 彬]