张建峰，庞思娜，曲同宝

(1.吉林农业大学生命科学学院，吉林长春130118;2.吉林农业大学园艺学院，吉林长春130118)

松嫩草地作为东北平原的天然生态屏障，以其土质优良、水草资源丰富，气候适宜而驰名，适合放养家畜。羊草(Leymus chinensis)是多年生根茎禾本科牧草，其生态适应性强，对干旱严寒贫瘠等恶劣环境具有很强的忍耐力，是松嫩草地的优势物种。羊草生长旺盛，草质细嫩，具有较高的营养价值，草食牲畜喜食，是畜牧业的重要原料来源［1］。

放牧是松嫩草地草类资源利用的主要方式之一，放牧可导致植物特征发生变化，进一步改变土壤理化性质和土壤微生物群落功能多样性［2］。土壤微生物在保持土壤肥力，促进生态系统稳定方面起着重要作用［3］。Biolog-ECO法是通过微生物利用31种碳底物时氧化还原反应的颜色变化情况来反映微生物碳源利用活性的方法［4-5］。本研究主要利用Biolog-ECO法分析放牧方式对松嫩草地羊草群落土壤微生物群落碳源利用的影响，为过度放牧导致土壤退化提供理论支持，进而为草原科学放牧提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究地区概况

研究区域位于吉林省长岭县东北师范大学松嫩草地生态研究站(35°23.1'－ 35°34.1'N、123°30'20.5″－123°30'45.0″E)，海拔 137.8 ～144.8 m，属于温带半干旱季风气候，年均气温4.6～6.4 ℃，无霜期 136～163 d。年降水量350～500 mm，多集中在6－9月，占全年降水量80%以上。土壤类型为碱化与盐化草甸土，群落类型以羊草和杂类草群落为主，羊草群落占绝对优势，其次还分布着芦苇(Phragmites australis)群落、虎尾草(Chloris virgata)群落、全叶马兰(Kalimeris integrifolia)群落、拂子茅(Calamagrostis epigeios)群落、碱茅(Puccinellia tenuiflora)群落、碱蓬(Suaeda auca)群落，形成镶嵌分布格局。

1.2 试验设计与牧草土壤样品采集

在羊草群落样地设置不放牧、轻牧和重牧3种放牧方式，每个处理设3个重复。放牧时间为每年5月10日－9月10日，每天放牧2 h。每块样地面积为150 m2。根据本研究站的研究数据［6］，放牧强度设置为不放牧、轻牧(4只羊·hm－2)、重牧(6只羊·hm－2)。

2012年的8月，在试验地内采集样品，土样的采集在样地植物盖度和均匀度最高时进行。样方大小为1 m2，3次重复。用刻度尺测量样方内植物高度，然后齐地面刈割，装入密封袋，数取其个数并称量鲜物质量，然后于70℃烘干至质量恒定，称量干物质量。

土壤样品取样方式为“五点混合法”，土钻直径2 cm，取样深度20 cm。剔除新鲜土样中石砾及植物残茬等杂物，5点混匀后，约取600 g装入无菌样品袋中，置于冰盒内尽快带回实验室。过2 mm筛，将土样分两份，一份烘干用于理化性质试验，一份放入－20℃冰箱保存，用于Biolog试验。

1.3 土壤理化性质测定

使用pH计和电导率仪测定土壤pH值和土壤电导率，土壤含水量采用烘干法，有机质含量用重铬酸钾容量法，铵态氮采用KCl浸提－靛酚蓝比色法，土壤全氮含量用凯氏定氮法，土壤全磷含量采用钼锑抗比色法［7］。

1.4 Biolog微生物测定

测定土壤含水率后，称取相当于5 g烘干土壤的新鲜土壤，用85%无菌NaCl按10倍稀释法制成10－4的土壤稀释液，每次转移用振荡器混匀(5 min，180 r·min－1)。稀释液颜色较深时，可用1 500 r·min－1离心3 min。将土壤稀释液导入样品槽，用8头移液枪从样品槽中吸取150μL接种液，注入ECO微平板的每个微孔，确保每个微孔移入量相等，并避免土壤稀释液溅入其他孔中［8-9］。将微平板放入恒温培养箱，在25℃下培养10 d［10］，每天用 Biolog读数仪读数两次，做土壤微生物平均吸光值随时间变化曲线等数据分析。

1.5 数据处理

微孔板的颜色变化用单孔颜色平均值(Average Well Color Development，AWCD)来表示，小于0.06的值按0处理［11］。AWCD=Σ(C590－C750)/31，式中，C590为单孔在590 nm的吸光度值减去对照孔吸光度值;C750为单孔在750 nm的吸光度值减去对照孔吸光度值。

土壤微生物群落的多样性和均匀度用以下指数来评价:

式中，Pi=(C590－C750)/Σ(C590－C750)，S为 ECO板中颜色变化孔的数目。

用拐点处的吸光度值进行主成分分析。数据处理软件为Microsoft Excel 2003，方差分析软件为SPSS 16.0，主成分分析软件为 Canoco for Windows 4.5。

2 结果与分析

2.1 不同放牧强度下羊草群落特征变化

放牧强度对羊草群落特征的影响较大，各项指标都有显著差异(P＜0.05)(表1)。随着放牧强度的增加植被高度显著降低(P＜0.05);植被盖度和地上生物量在不放牧和重度放牧下差异不显著(P＞0.05)但均显著低于轻度放牧下的;密度在重度放牧时最低;适度放牧方式下植被盖度、密度和地上生物量都达到最高。

2.2 不同放牧强度土壤理化性质变化

7个理化指标中仅有机质和pH值有显著差异(P＜0.05)(表2)。铵态氮和有机质含量在不放牧时最高，轻牧次之，重牧时最低。pH值重牧时最高，轻牧时次之，不放牧时最低。全氮、含水量、电导率和有效磷无显著差异(P＞0.05)。

表1 不同放牧强度下植被特征Table 1 Changes of vegetation characteristics under different grazing intensities

表2 不同放牧强度下土壤理化性质Table 2 Physicochemical properties of soil under different grazing intensities

2.3 土壤微生物的平均吸光值

每隔12 h测ECO板孔平均颜色变化(AWCD)值，用培养10 d所得的20个AWCD值做图，随培养时间的延长 AWCD值升高(图1)。24 h之内AWCD值无明显变化，碳源基本未被利用;24 h之后AWCD值开始升高;72 h左右AWCD值急剧升高，进入指数期，说明碳源开始被大幅度利用;180 h左右AWCD值变化趋于平稳。3个土壤样品中，36－144 h，轻牧和重牧AWCD值增长趋势相近;156 h至培养结束，轻牧AWCD高于重牧;不放牧AWCD一直维持较低水平。

2.4 土壤微生物对碳源的利用

Biolog-ECO微平板的31种碳源可分为碳水化合物类、氨基酸类、羧酸类、多聚物类、酚酸类和胺类六大类。根据不同碳源的平均吸光度值随时间的变化做曲线，样地中利用多聚物的微生物占绝对优势，其次为利用胺类、氨基酸类和碳水化合物的微生物。碳水化合物类为轻牧＞重牧＞不放牧;氨基酸类为重牧高于轻牧和不放牧，轻牧和不放牧趋势相近;羧酸类为不放牧前期较高，后期重牧较高;多聚物类为重牧＞轻牧＞不放牧;酚酸类为不放牧最高，轻牧和重牧趋于0。胺类为重牧高于轻牧高于不放牧(图2)。

图1 土壤微生物平均吸光值变化曲线Fig.1 Curve of AWCD change of soil microorganism

图2 土壤微生物对不同碳源利用的变化曲线Fig.2 Curve of AWCD change of soil microorganism with different carbon sources

2.5 土壤微生物碳源利用多样性指数分析

Shannon丰富度指数、Shannon均匀度指数和Gini多样性指数用来测度土壤微生物群落多样性的高低，是反映丰富度和均匀度的综合指标。不放牧时，群落多样性较高，说明不放牧可提高群落多样性，其次为重牧和轻牧(图3)。

图3 土壤微生物碳源利用多样性指数Fig.3 Diversity index of carbon source metabolism of soil microorganism

2.6 土壤生化指标与微生物功能多样性主成分分析

Canoco for Windows 4.5软件对土壤生化指标和土壤微生物拐点180 h吸光度数据做主成分分析，length＜3，选择 RDA 分析［12］。根据蒙特卡罗检验结果发现，第1轴可以解释74.2%的变量，第2轴可以解释25.8%的变量。沿第1轴方向放牧强度依次为轻牧、重牧、不放牧。铵态氮、全氮和有机质与不放牧正相关，与重牧负相关;pH值、电导率和含水量与重牧正相关，与不放牧呈负相关;有效磷和铵态氮与轻牧负相关(图4)。不放牧下，利用碳源种类较少，主要为代谢L-苏氨酸、肝糖和γ-羟丁酸等碳源的微生物;轻牧下，土壤中主要为代谢 α-D-乳糖、N-乙酰基-D-葡萄胺、α-D-葡萄糖-1-磷酸等碳水化合物类碳源的微生物;重牧时，土壤中代谢吐温40和L-精氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸等氨基酸类碳源的微生物较多。

图4 土壤微生物功能多样性RDA分析Fig.4 RDA on the functionol diversity of edaphon

3 讨论

放牧会改变牧草生长特征。由于牧畜的啃食，随着放牧强度的增大，牧草高度有降低的趋势;重度放牧强度下由于牧草基本没有休养生息的机会，导致各项指标均处于较低水平;适度放牧时植被盖度、密度和地上生物量都达到顶峰，说明适度放牧有利于牧草的再生繁殖。刘颖等［6，13］的研究表明，适度放牧会增加牧草生产力，促进牧草再生，再生草量和再生速率最大，与本研究结果一致。以上几种植被特征指标的共同作用致使植物光合作用面积改变，进而通过提供微生物生长繁殖所需营养物质间接影响土壤微生物的数量［6］。草食动物通过采食、践踏及排泄活动影响植物的生理活动，进而通过根系分泌物影响土壤理化性质和土壤微生物群落代谢功能多样性［14-15］。土壤含水量、pH值、盐度和化学组成等理化性质也会改变土壤微生物种类及数量［16］。土壤微生物也会通过其代谢活动改变土壤理化性质。因此，放牧强度、土壤理化性质、植物和土壤微生物之间相互影响关系紧密。

理化性质分析表明，在短期放牧条件下，放牧强度对土壤pH值和有机质含量有影响，其他指标差异不显著(P＞0.05)。重牧情况下，植物生产力降低对土壤的影响大于羊排泄物对土壤的影响，导致土壤pH值升高有机质含量降低，土壤肥力下降。对AWCD值随时间变化曲线分析表明，适度放牧样地土壤微生物群落代谢功能最强，不放牧样地土壤微生物群落代谢功能最弱。放牧有利于土壤微生物代谢活动，适度放牧可使羊草生长加快［17］，根际分泌物使微生物可利用碳源增多［18］，牲畜粪便也会增加碳源来源［19］。张海芳等［20］的研究表明，围封时土壤微生物群落代谢活性最高，自由放牧次之，刈割最低。对碳源利用率分析表明，样地中利用多聚物的微生物较多，可能样地土壤中含有较多的多聚物，这有待进一步试验分析。

对多样性指数分析表明，不放牧样地土壤微生物种类丰富度和均匀度较高，因为不放牧样地植物高度和盖度均最高，根系分泌物的增多有利于土壤微生物的聚集与增殖，不放牧样地的土壤理化性质也更适于土壤微生物的生存。重牧样地土壤微生物多样性指数较轻牧稍高，但差异不显著，说明短期放牧对土壤微生物丰富度和均匀度影响不大。高雪峰等［21］的研究显示，轻度和适度放牧有利于土壤中微生物数量和种类的增加，与本研究结果相似。

RDA分析表明，不放牧样地土壤微生物与铵态氮、全氮和有机质关系密切，适度放牧样地土壤微生物仅与含水量和电导率有些许关系，重度放牧样地磷含量、pH值对土壤微生物起作用。轻牧样地土壤微生物利用碳源较丰富，主要有α-D-乳糖、N-乙酰基-D-葡萄胺、α-D-葡萄糖-1-磷酸等，大多数碳源为碳水化合物类;重度放牧样地土壤微生物主要利用吐温40、L-精氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸和 D-纤维二糖;不放牧样地土壤微生物利用碳源种类最少。分析其原因:不同放牧强度影响植被生长和繁殖，牲畜排泄物和羊草根系分泌物共同形成土壤碳源差别，从而导致土壤微生物种类和数量上的差异。

综合以上结果表明，适度放牧有利于土壤肥力的保持，植被的生长和土壤微生物种类与数量的增加。

4 结论

1)放牧强度显著影响羊草草地植被特征，适度放牧方式下植被盖度、密度和地上生物量都达到最高。适度放牧有利于草原植物的生长繁殖和生物量的积累。

2)短期放牧条件下随着放牧强度的增大，土壤pH值增大有机质含量降低。放牧强度对其他土壤理化性质的影响不显著。

3)短期放牧条件下，放牧强度对羊草群落土壤微生物群落多样性影响不大。但不同放牧强度下，土壤微生物利用碳源种类出现较大差别，说明放牧强度会显著改变土壤碳源类别。

4)轻牧方式下，土壤微生物群落代谢功能最强;不放牧方式下，土壤微生物群落代谢功能最弱，代谢最慢。适度放牧可促进微生物的生长与繁殖，提高其代谢活性，更利于该地区生态环境的均衡发展。

［1］李建东.东北草原草本食物基本生活型的探讨［J］.吉林师大学报，1979(2):143-155.

［2］李春莉，赵萌莉，韩国栋，红梅.放牧对短花针茅草原土壤微生物和土壤养分的影响及其季节动态［J］.干旱区资源与环境，2009，23(4):184-190.

［3］Nannipieri P，Ascher J，Ceccherini M T，Landi L，Pietramellara G，Renellam G.Microbial diversity and soil functions［J］.European Journal of Soil Science，2003，54:655-670.

［4］Garland JL，Mills A L.Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on the basis of patterns of community-level sole-carbon-source utilization ［J］.Applied and Environmental Microbiology，1991，57:2351-2359.

［5］田雅楠，王红旗.Biolog法在环境微生物功能多样性研究中的应用［J］.环境科学与技术，2011，34(3):50-57.

［6］刘颖，王德利，王旭，巴雷，孙伟.放牧强度对羊草草地植被特征的影响［J］.草业学报，2002，11(2):22-28.

［7］乔胜英.土壤理化实验指导书［M］.武汉:中国地质大学出版社，2012:42-68.

［8］席劲瑛，胡洪营，钱易.Biolog方法在环境微生物群落研究中的应用［J］.微生物学报，2003，43(1):138-141.

［9］郑华，欧阳志云，方志国，赵同谦.BIOLOG在土壤微生物群落功能多样性研究中的应用［J］.土壤学报，2004，41(3):456-461.

［10］贾夏，董岁明，周春娟.微生物生态研究中Biolog Eco微平板培养时间对分析结果的影响［J］.应用基础与工程科学学报，2013，21(1):10-19.

［11］Classen A T，Boyle SI，Haskins K E，Overby ST，Hart SC.Community-level physiological profiles of bacteria and fungi:plate type and incubation temperature influences on contrasting soils［J］.FEMSMicrobiology Ecology，2003，443.

［12］O＇Connell S，Lawson R D，Watwood M E，Lehman R M.BASICprogram for reduction of data from community-level physiological profiling using biolog microplates:Rationale and critical interpretation of data［J］.Journal of Microbiological Methods，2000，403.

［13］刘颖，王德利，韩士杰，王旭.放牧强度对羊草草地植被再生性能的影响［J］.草业学报，2004，13(6):39-44.

［14］Cingolani A M，Posse G，Collantes M B.Plant functional traits，herbivore selectivity and response to sheep grazing in Patagonian steppe grasslands［J］.Journal of Applied Ecology，2005，42:50-59.

［15］Manzano M G，Navar J.Processes of desertification by goats overgrazing in the Tamaulipan thornscrub(matorral)in north-eastern Mexico［J］.Journal of Arid Environments，2000，44:1-17.

［16］Pengthamkeerati P，Motavalli PP，Kremer R J.Soil microbial activity and functional diversity changed by compaction，poultry litter and cropping in a claypan soil［J］.Applied Soil Ecology，2011，48:71-80.

［17］程积民，邹厚远.封育刈割放牧对草地植被的影响［J］.水土保持研究，1998，5(1):36-54.

［18］Rodriguez-Loinaz G，Onaindia M，Amezaga I，Mijangos I，Garbisub C.Relationship between vegetation diversity and soil functional diversity in native mixed-oak forests［J］.Soil Biology and Biochemistry，2008，40:49-60.

［19］Clegg C D.Impact of cattle grazing and inorganic fertilizer additions to managed grasslands on the microbial community composition of soils［J］.Applied Soil Ecology，2006，31:73-82.

［20］张海芳，李刚，宋晓龙，刘红梅，张静妮，杨殿林，赵树兰，多立安.内蒙古贝加尔针茅草原不同利用方式土壤微生物功能多样性［J］.生态学杂志，2012(5):1143-1149.

［21］高雪峰，武春燕，韩国栋.草原土壤微生物受放牧的影响及其季节变化［J］.微生物学通报，2010，37(8):1117-1122.