郭颖慧+孙红炜+李凡+杨淑珂+杨正友+路兴波

摘 要：以转植酸酶玉米10TPY005、非转植酸酶亲本玉米蠡玉35的花粉分别饲喂家蚕3个龄期，取3龄末期家蚕利用Biolog-Eco法分别从其肠道微生物群落多样性的平均颜色变化率（AWCD值）、四种碳源利用率、群落代谢功能多样性指数（Shannon、Simpson和McIntosh指数）及主成分分析四个方面进行指标测定，从而研究转植酸酶玉米对家蚕肠道环境菌群多样性的影响。结果表明：转植酸酶玉米花粉喂食的家蚕与亲本玉米花粉喂食和空白对照两组家蚕相比，上述各指标总体无显著性差异，即转植酸酶玉米对家蚕肠道微生物多样性未造成明显影响。

关键词：转植酸酶玉米；家蚕；肠道微生物多样性

中图分类号：S513+Q785 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）11-0119-05

玉米含磷丰富，但65%以上的磷以植酸磷形式存在。由于猪及禽类等单胃动物缺乏分解植酸的内源性酶系统，所以植酸磷对于这些动物没有营养价值，还可能造成有效磷利用率低以及环境污染等问题。只有植酸酶才能把磷从植酸与磷复合物中释放出来被动物吸收利用[1]。转植酸酶玉米是通过基因工程技术，将微生物中能够高效表达植酸酶的基因通过加工修改后导入到玉米基因组中，让其成为能够表达植酸酶的玉米新品种。转植酸酶基因玉米10TPY005由中国农业科学院生物技术研究所培育完成，用作动物饲料无需添加外源植酸酶，已经获生产应用安全证书，商品化前景较好。

转基因技术在农业上的应用， 推动了世界转基因作物技术与产业化的迅速发展[2]。虽然转基因作物有很多优点，但转基因食品的安全性问题，一直是人们关注的焦点[3]。目前，已有转植酸酶基因玉米生育期及秸秆还田期对根际微生物数量和细菌菌群多样性的影响[4]及转植酸酶玉米花粉对亚洲玉米螟和棉铃虫生长发育影响的研究[5]，对田间昆虫种群的影响也有报道[6]，然而关于转植酸酶基因植物对某些昆虫肠道微生物多样性影响的研究还鲜有报道。家蚕为鳞翅目昆虫的代表，喜食桑叶且具有寡食性，桑树多依靠玉米大田生长，转植酸酶玉米花粉经风吹落于桑叶易被家蚕食用。因此研究转植酸酶玉米花粉对家蚕肠道微生物多样性的影响，有助于从昆虫肠道群落角度科学评价转植酸酶基因玉米的生态风险，可以为转植酸酶基因作物的合理种植提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

转植酸酶基因玉米10TPY005（奥瑞金公司提供），蠡玉35（10TPY005亲本对照），家蚕品种皓月（山东省蚕业研究所科研用蚕）。

1.2 试验设计

试验地位于山东省农业科学院农场工作站，两个玉米品种各设立3个重复小区。每小区长100 m，宽3 m，株距20 cm，行距60 cm。试验田四周300 m为菜田及建筑物，无玉米种植。玉米生育过程中不施肥不喷洒农药。

在玉米雄蕊抽出、尚未散粉前，用授粉袋将玉米雄蕊套住，每小区套10株玉米。在玉米散粉盛期，分别将转基因玉米和非转基因玉米取回到实验室。采集花粉用200目分样筛过筛，除去花药等杂质，放入50 mL离心管中，迅速用液氮冷冻后放入-20℃冰箱中保存备用。

将转基因玉米和非转基因玉米花粉按每毫升蒸馏水0、1、5、10 mg的花粉量分别制成不同花粉浓度的悬浮液，将新鲜桑叶分别放入不同浓度的花粉悬浮液中，并充分摇动，使花粉均匀分布在叶片上，然后取出晾干。

取直径20 cm的培养皿，底部铺一湿润的滤纸，放入沾有玉米花粉的新鲜桑树叶片，然后接入20头家蚕，每2 d更换一次新鲜叶片，在25℃、光照周期12L∶ 12D条件下进行饲喂，到3龄眠蚕结束，每处理重复5次。

试验用家蚕分别进行如下标记：空白CK：不加玉米花粉；A1：加1 mg/mL转植酸酶玉米花粉；A5：加5 mg/mL转植酸酶玉米花粉；A10：加10 mg/mL转植酸酶玉米花粉； 351：加1 mg/mL蠡玉35玉米花粉； 355：加5 mg/mL蠡玉35玉米花粉； 3510：加10 mg/mL蠡玉35玉米花粉。

1.3 测定方法

取3龄末期家蚕用75%乙醇体表消毒3 min，再用0.8%生理盐水清洗。无菌状态下解剖取出家蚕肠道，用 0.8%生理盐水清洗后收集至2.0 mL离心管，加 0.8%生理盐水200 μL，研磨匀浆后定容至15 mL。

将研磨好的样品加到Biolog-Eco微平板中，每孔150 μL，每样一板，每处理重复3次。将Biolog-Eco微平板置于恒温培养箱（30℃）中培养168 h，每隔24 h用Biolog读数仪读数1次[7]。

1.4 数据统计分析

微生物整体活性指标采用微平板每孔平均颜色变化率（AWCD）表示，计算公式为：

AWCD=∑（A-ACK）31

式中：A为每个碳源孔590 nm下的吸光度值减去750 nm下的吸光度值；ACK为对照孔的吸光度值。

利用各样品培养的数据，计算其微生物群落多样性的Shannon指数（H′）、Simpson指数（D）和McIntosh指数（U）。

式中：Pi为第i孔的相对吸光值与整个平板相对吸光值总和的比率；ni是第i孔的相对吸光值[8]。

采用统计软件DPS进行方差分析和主成分分析，多重比较采用Duncan s新复极差法。

2 结果与分析

2.1 家蚕肠道微生物群落平均颜色变化率的动态变化

平均颜色变化率（AWCD）是反映微生物群落整体活性的一个重要指标。微生物种类和数量越多，微孔板中能够被利用的碳源种类和数量也就越多。由图1可知，家蚕肠道微生物群落代谢的AWCD值随时间变化的曲线具有一般微生物利用碳源底物的规律性（随着培养时间的延长，微生物利用的碳源量均呈逐渐增多的趋势，24～72 h增长迅速，此后逐渐趋于平稳并达到12左右），即对环境存在比较明显的适应期、对数期和稳定期等阶段。喂食转植酸玉米花粉及亲本玉米花粉的家蚕肠道微生物群落平均颜色变化率（AWCD）无显著性差异。endprint

2.2 家蚕肠道微生物群落对四类碳源的利用率

根据Bidog-Eco微平板中的碳源种类，可以将其归类为糖类及其衍生物、氨基酸及其衍生物、脂肪酸和脂类及代谢中产物和次生代谢物四大类[9]。

采用96 h光密度值分析不同浓度不同基因型玉米花粉喂食的家蚕肠道微生物对四种类型碳源的利用程度。从图2可以看出，家蚕肠道微生物对碳源的利用主要集中在糖类及其衍生物类碳源与脂类及脂肪酸类碳源上，对氨基酸及衍生物类碳源的利用率居中，对中间代谢产物及其次生代谢产物的利用程度最低。食用转植酸酶玉米花粉、蠡玉35玉米花粉和空白对照的家蚕肠道微生物对每类碳源的利用率无显著性差异。

2.3 家蚕肠道微生物群落代谢功能多样性指数分析

Shannon指数（H′）用以评估群落中物种的丰富度，转植酸酶玉米花粉、蠡玉35玉米花粉喂食的家蚕肠道微生物群落Shannon多样性指数差异不显著（表1）。Simpson指数（D）较多地反映群落中常见的物种，是衡量群落功能多样性的一个重要指标[10]。如表1所示，食用转植酸酶玉米花粉与非转植酸酶玉米花粉和空白对照的家蚕肠道微生物的Simpson指数无显著性差异。McIntosh指数（U）是对微生物群落物种均一性的衡量[11]，由表1可知，转植酸酶玉米花粉和非转基因玉米花粉喂食的家蚕及空白对照的肠道微生物群落McIntosh均匀度指数同样没有显著性差异。可见，转植酸酶玉米花粉对家蚕肠道微生物群落的物种丰富度、最常见物种的优势度和均匀度无明显影响。

2.4 家蚕肠道微生物群落代谢功能主成分分析

利用培养96 h测定的AWCD值，对转基因和两种对照组的家蚕肠道微生物群落利用Biolog 微平板中31种碳源（表3）的情况进行了主成分分析，得到的主元向量中6个主成分特征值的贡献率与累积贡献率如表2，可见6个主成分即可表征原变量的全部信息。

主成分分析将不同样品的多元向量变换为互不相关的主分向量，在其空间中可用点的位置直观反映出不同微生物群落的代谢特征。由图3可知，喂食不同浓度不同基因型花粉的家蚕肠道微生物群落的碳源利用模式相似，加1 mg/mL转植酸酶玉米花粉和蠡玉35玉米花粉喂食的家蚕均分布在x轴负方向，加5 mg/mL转植酸酶玉米花粉和蠡玉35玉米花粉喂食的家蚕也均分布在x轴负方向，加10 mg/mL转植酸酶玉米花粉和蠡玉35玉米花粉喂食的家蚕均分布在x轴正方向，说明x轴没有对不同基因型玉米花粉喂食的家蚕肠道微生物碳源利用模式造成主要分异，不同基因型碳源利用模式相同。

第1主成分、第2主成分、第3主成分和第4主成分累积贡献率达到85.776%，因此，可以说微生物群落对31种单一碳源的利用有85.776%是与PC1、PC2、PC3和PC4呈正相关的（表3）。α-D-乳糖、吐温 80、D-甘露醇、α-环式糊精、N-乙酰-D葡萄糖氨等与第一轴的关系最大，说明糖类碳源在PC1轴上权重较大。2-羟基苯甲酸、β-甲基-D-葡萄糖苷、4-羟基苯甲酸、D-半乳糖酸-γ-内酯、1-磷酸葡萄糖等与第二轴的关系最大，说明中间及次生代谢产物类碳源和糖类碳源在PC2轴上权重较大。丙酮酸甲酯、L-苏氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸等与第三轴的关系最大，说明脂肪酸及脂类和氨基酸衍生物在PC3轴上权重较大。1-磷酸葡萄糖、α-丁酮酸、D-苹果酸等与第四轴的关系最大，说明中间及次生代谢产物类碳源在PC4轴上权重较大。

3 结论与讨论

昆虫肠道微生物与其消化、营养以及发育密切相关[12]。肠道微生物群落的丰富度和群落结构功能的多样性是衡量昆虫肠道是否健康的一个重要指标。因此，评价转植酸酶玉米花粉对家蚕肠道微生物的影响，可在一定程度探明其对家蚕生物学的影响。

Biolog-Eco微平板共有31种碳源，每孔平均颜色变化率（AWCD）能够反映微生物群落的整体碳源代谢活性。从理论上讲，微生物个体数量多且种群丰富，AWCD值可达到最大值；若微生物个体数量少而种群丰富，则开始时AWCD值较小，但随着时间的延长AWCD值逐渐增加[13]。本试验结果表明，家蚕的肠道微生物AWCD值在96 h之前均随培养时间延长呈现迅速增大的趋势，此后逐渐趋于平稳，并且食用不同浓度不同基因型玉米花粉的家蚕肠道微生物之间无显著性差异，说明家蚕肠道微生物均能利用相关碳源且种群丰富、个体数量多、代谢活性较强。

采用96 h光密度值分析不同浓度不同基因型玉米花粉喂食的家蚕肠道微生物对糖类及其衍生物类碳源、脂类及脂肪酸类碳源、氨基酸及其衍生物类碳源和中间代谢产物及其次生代谢产物碳源类型的利用程度，转植酸酶玉米花粉喂食的家蚕肠道微生物对碳源的利用率与食用蠡玉35玉米花粉和空白对照相比无显著性差异。

从家蚕肠道微生物的Shannon、Simpson、McIntosh多样性指数分析可知，转植酸酶玉米花粉对家蚕肠道微生物群落的物种丰富度、最常见物种的优势度和均匀度无明显影响。主成分分析表明，不同浓度、不同基因型的玉米花粉喂食的家蚕肠道微生物的碳源利用模式不存在显著差异。

转植酸酶玉米花粉被家蚕取食后可能发生以下几种情况：（1）转植酸酶在家蚕消化道内未被溶解，而直接排出体外；（2）转植酸酶被溶解，但在消化道内有少量被消化吸收，大部分被排出体外；（3）转植酸酶被家蚕吸收，但通过自身解毒酶的作用，将其降解[14]。 上述结果均未显示出显著性差异，即转植酸酶玉米花粉对家蚕肠道微生物不具有显著影响，从这个程度上来说，转植酸酶玉米对家蚕肠道微生物多样性是安全的。但是本研究供试转植酸酶玉米花粉中的PhyA2基因是否可能存在于家蚕的肠道细菌中还有待检测。

参 考 文 献：

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