陈新+张庆霞+徐丽+贾建云+王甲威+刘庆忠

摘 要：本试验采用ISSR技术对12份樱桃种质资源的遗传多样性进行了研究。筛选出6条ISSR引物对供试材料进行扩增，共检测到48个遗传位点，包含44个多态性位点，多态性位点百分率为91.67%。材料间遗传相似系数为0.29～0.98，平均为0.65。当阈值为0.58时，供试样品可分为3个组，即组Ⅰ、组Ⅱ和组Ⅲ。遗传相似性分析结果显示材料间具有丰富的遗传多样性。

关键词：樱桃；遗传多样性；ISSR

中图分类号：S662.501 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）11-0012-03

樱桃为蔷薇科（Rosacea）李属（Prunus）樱桃组植物，多分布在亚洲和欧洲[1]，全世界樱桃组植物约有120种以上，主要分布于北半球温和地带。中国栽培樱桃已有3000多年的历史。我国栽培的樱桃可分为四大类，即中国樱桃、甜樱桃、酸樱桃和毛樱桃[2]，其中以中国樱桃和甜樱桃为主要栽培对象。我国樱桃种质资源丰富，华北、华中及两广地区皆有分布，尤以浙江、山东、河南、江苏、陕西、四川、安徽、河北分布最多，为充分挖掘樱桃种质资源提供了天然条件[3，4]。

ISSR（Inter-simple sequence repeat） 是Zietkiewitcz等于1994年发展起来的微卫星基础上的分子标记[5]，是一种简单重复序列之间扩增多态性分子标记。其利用基因组中有关SSR序列信息，引物的开发较SSR引物简单，且可以在不同的物种间通用，不像SSR标记一样具有较强的种属特异性。ISSR分子标记不仅具有SSR标记的稳定性且揭示的多态性较RAPD高[6，7]，是一种非常理想的分子标记技术，目前已广泛用于植物品种鉴定、遗传作图、遗传多样性及分子生态学研究。本试验采用ISSR标记技术对山东省部分主栽樱桃品种和砧木资源进行检测，并分析其遗传背景差异，对樱桃资源的科研、生产具有重要的实际应用价值和科学价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用材料均于2014年4月采自山东省果树研究所樱桃品种资源保存圃，所用12份材料均为目前生产上的主要栽培品种。随机采取健康嫩叶迅速于液氮中冷冻，放于-80℃冰箱保存备用。样品编号及品种见表1。

1.2 模板DNA的制备

采用改良CTAB法[8]提取叶片的基因组DNA，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测其质量。稀释DNA至终浓度10 ng/μL，-20℃储存备用。

1.3 ISSR反应

ISSR引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成，筛选出6条用于PCR（表2）。PCR扩增体系为20 μL，其中10 × buffer （含Mg2+） 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，10 μmol/L Primer 1 μL，2.5 U/μL Taq聚合酶0.4 μL，10 ng/μL DNA模板1 μL 和无菌ddH2O 14 μL。PCR 反应程序为95℃ 5 min；95℃ 1 min，48℃ 1 min，72℃ 1 min，35 个循环；72℃ 10 min，程序结束后进入4℃保存。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离检测，于紫外灯下观察，并拍照保存。

1.4 数据统计分析

将所获得的电泳谱带进行数字化统计，按照图谱中同一位置条带的“有”、“无”进行统计，有带标记为“1”，无带标记为“0”，仅记录重复性好、条带清晰且片段为200～750 bp 范围内的扩增带。将DNA扩增带数据输入到数据矩阵，通过NTSYSpc（version 2.11 a）采用非加权类平均法（UPGMA）进行聚类分析建立聚类图，并计算遗传相似系数。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增产物的多态性分析

6条引物均能对12份樱桃种质基因组DNA扩增出清晰稳定的多态性条带，图1为引物ISSR36扩增的带型。本试验共检测到48个遗传位点，其中包含44个多态性遗传位点，多态性位点比率为91.67%（表2）。同一样品的不同引物扩增条带数量和多态性差异较大。

2.2 遗传相似性

12份樱桃种质个体间的相似系数为0.29～0.98，平均值为0.65。其中1与4和2与3的遗传相似系数最大，为0.98，说明其遗传距离最近，即亲缘关系最近，5与10 的遗传相似系数最小，仅为0.29，说明二者遗传相似性最低，亲缘关系最远。

2.3 聚类分析

对供试12份种质进行聚类分析，结果表明，品种间遗传背景有较大的差异，遗传多样性丰富。在相似系数0.58处，12个品种可聚类为3个组（图2），其中，1、4、10、2、3、11和12聚为一个分支，为组Ⅰ；5和9聚为一个分支，为组Ⅱ；6、7和8聚为一个分支，为组Ⅲ。

3 结论

6条ISSR 引物均能有效扩增出多态性条带，说明ISSR标记是樱桃遗传分析的有效工具。供试12个样品间的相似系数分布在0.29～0.98之间，ISSR标记能将供试样品完全区分开。品种间具有丰富的遗传多样性，亲缘关系复杂，遗传背景存在很大差异。物种的地理分布特征也可能影响其遗传多样性水平，一般而言，广泛分布比狭域分布的物种具有更高的遗传多样性[9]，供试樱桃品种间表现出较高遗传多样性，可能与它们地理分布相对较广有关。参 考 文 献：

[1] 俞德浚.中国植物志[M].北京：科学出版社， 1986： 46-87.

[2] 于亚军，代汉萍，李宝江，等. 世界樱桃育种进展[J]. 果树学报，2003，20（2）：135-139.

[3] 胡正刚.中国樱桃的分布及生产现状[J].落叶果树， 1996（3）：29-30.

[4] Li M M，Cai Y L，Qian Z Q， et al. Genetic diversity and differentiation in Chinese sour cherry Prunus pseudocerasus Lindl.， and its implications for conservation[J]. Genetic Resources and Crop Evolution， 2009， 56（4）： 455-464.

[5] Zietkiewicz E， Rafalski A， Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics， 1994， 20： 176-183.

[6] Sanchez de la Hoz M P，Davila J A，Loarce Y，et al. Simple sequence repeat primers used in polymerase chain reaction amplifications to study genetic diversity in barley [J]. Genome， 1996， 39（1）： 112-117.

[7] Ratnaparkhe M B，Santra D K，Tullu A，et al. Inheritance of inter-simple-sequence-repeat polymorphisms and linkage with a fusarium wilt resistance gene in chickpea [J].Theor. Appl. Genet.， 1998， 96（3/4）： 348-353.

[8] 陈新.榛子花芽转录组文库的Solexa 测序及冷调节基因的表达谱分析[D].北京：中国林业科学研究院，2011.

[9] Nybom H， Bartish I V. Effects of life history traits and sampling strategies on genetic diversity estimates obtained with RAPD markers in plants [J]. Perspectives in Plant Ecology， Evolution and Systematics， 2000， 3（2）：93-114.

摘 要：本试验采用ISSR技术对12份樱桃种质资源的遗传多样性进行了研究。筛选出6条ISSR引物对供试材料进行扩增，共检测到48个遗传位点，包含44个多态性位点，多态性位点百分率为91.67%。材料间遗传相似系数为0.29～0.98，平均为0.65。当阈值为0.58时，供试样品可分为3个组，即组Ⅰ、组Ⅱ和组Ⅲ。遗传相似性分析结果显示材料间具有丰富的遗传多样性。

关键词：樱桃；遗传多样性；ISSR

中图分类号：S662.501 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）11-0012-03

樱桃为蔷薇科（Rosacea）李属（Prunus）樱桃组植物，多分布在亚洲和欧洲[1]，全世界樱桃组植物约有120种以上，主要分布于北半球温和地带。中国栽培樱桃已有3000多年的历史。我国栽培的樱桃可分为四大类，即中国樱桃、甜樱桃、酸樱桃和毛樱桃[2]，其中以中国樱桃和甜樱桃为主要栽培对象。我国樱桃种质资源丰富，华北、华中及两广地区皆有分布，尤以浙江、山东、河南、江苏、陕西、四川、安徽、河北分布最多，为充分挖掘樱桃种质资源提供了天然条件[3，4]。

ISSR（Inter-simple sequence repeat） 是Zietkiewitcz等于1994年发展起来的微卫星基础上的分子标记[5]，是一种简单重复序列之间扩增多态性分子标记。其利用基因组中有关SSR序列信息，引物的开发较SSR引物简单，且可以在不同的物种间通用，不像SSR标记一样具有较强的种属特异性。ISSR分子标记不仅具有SSR标记的稳定性且揭示的多态性较RAPD高[6，7]，是一种非常理想的分子标记技术，目前已广泛用于植物品种鉴定、遗传作图、遗传多样性及分子生态学研究。本试验采用ISSR标记技术对山东省部分主栽樱桃品种和砧木资源进行检测，并分析其遗传背景差异，对樱桃资源的科研、生产具有重要的实际应用价值和科学价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用材料均于2014年4月采自山东省果树研究所樱桃品种资源保存圃，所用12份材料均为目前生产上的主要栽培品种。随机采取健康嫩叶迅速于液氮中冷冻，放于-80℃冰箱保存备用。样品编号及品种见表1。

1.2 模板DNA的制备

采用改良CTAB法[8]提取叶片的基因组DNA，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测其质量。稀释DNA至终浓度10 ng/μL，-20℃储存备用。

1.3 ISSR反应

ISSR引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成，筛选出6条用于PCR（表2）。PCR扩增体系为20 μL，其中10 × buffer （含Mg2+） 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，10 μmol/L Primer 1 μL，2.5 U/μL Taq聚合酶0.4 μL，10 ng/μL DNA模板1 μL 和无菌ddH2O 14 μL。PCR 反应程序为95℃ 5 min；95℃ 1 min，48℃ 1 min，72℃ 1 min，35 个循环；72℃ 10 min，程序结束后进入4℃保存。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离检测，于紫外灯下观察，并拍照保存。

1.4 数据统计分析

将所获得的电泳谱带进行数字化统计，按照图谱中同一位置条带的“有”、“无”进行统计，有带标记为“1”，无带标记为“0”，仅记录重复性好、条带清晰且片段为200～750 bp 范围内的扩增带。将DNA扩增带数据输入到数据矩阵，通过NTSYSpc（version 2.11 a）采用非加权类平均法（UPGMA）进行聚类分析建立聚类图，并计算遗传相似系数。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增产物的多态性分析

6条引物均能对12份樱桃种质基因组DNA扩增出清晰稳定的多态性条带，图1为引物ISSR36扩增的带型。本试验共检测到48个遗传位点，其中包含44个多态性遗传位点，多态性位点比率为91.67%（表2）。同一样品的不同引物扩增条带数量和多态性差异较大。

2.2 遗传相似性

12份樱桃种质个体间的相似系数为0.29～0.98，平均值为0.65。其中1与4和2与3的遗传相似系数最大，为0.98，说明其遗传距离最近，即亲缘关系最近，5与10 的遗传相似系数最小，仅为0.29，说明二者遗传相似性最低，亲缘关系最远。

2.3 聚类分析

对供试12份种质进行聚类分析，结果表明，品种间遗传背景有较大的差异，遗传多样性丰富。在相似系数0.58处，12个品种可聚类为3个组（图2），其中，1、4、10、2、3、11和12聚为一个分支，为组Ⅰ；5和9聚为一个分支，为组Ⅱ；6、7和8聚为一个分支，为组Ⅲ。

3 结论

6条ISSR 引物均能有效扩增出多态性条带，说明ISSR标记是樱桃遗传分析的有效工具。供试12个样品间的相似系数分布在0.29～0.98之间，ISSR标记能将供试样品完全区分开。品种间具有丰富的遗传多样性，亲缘关系复杂，遗传背景存在很大差异。物种的地理分布特征也可能影响其遗传多样性水平，一般而言，广泛分布比狭域分布的物种具有更高的遗传多样性[9]，供试樱桃品种间表现出较高遗传多样性，可能与它们地理分布相对较广有关。参 考 文 献：

[1] 俞德浚.中国植物志[M].北京：科学出版社， 1986： 46-87.

[2] 于亚军，代汉萍，李宝江，等. 世界樱桃育种进展[J]. 果树学报，2003，20（2）：135-139.

[3] 胡正刚.中国樱桃的分布及生产现状[J].落叶果树， 1996（3）：29-30.

[4] Li M M，Cai Y L，Qian Z Q， et al. Genetic diversity and differentiation in Chinese sour cherry Prunus pseudocerasus Lindl.， and its implications for conservation[J]. Genetic Resources and Crop Evolution， 2009， 56（4）： 455-464.

[5] Zietkiewicz E， Rafalski A， Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics， 1994， 20： 176-183.

[6] Sanchez de la Hoz M P，Davila J A，Loarce Y，et al. Simple sequence repeat primers used in polymerase chain reaction amplifications to study genetic diversity in barley [J]. Genome， 1996， 39（1）： 112-117.

[7] Ratnaparkhe M B，Santra D K，Tullu A，et al. Inheritance of inter-simple-sequence-repeat polymorphisms and linkage with a fusarium wilt resistance gene in chickpea [J].Theor. Appl. Genet.， 1998， 96（3/4）： 348-353.

[8] 陈新.榛子花芽转录组文库的Solexa 测序及冷调节基因的表达谱分析[D].北京：中国林业科学研究院，2011.

[9] Nybom H， Bartish I V. Effects of life history traits and sampling strategies on genetic diversity estimates obtained with RAPD markers in plants [J]. Perspectives in Plant Ecology， Evolution and Systematics， 2000， 3（2）：93-114.

摘 要：本试验采用ISSR技术对12份樱桃种质资源的遗传多样性进行了研究。筛选出6条ISSR引物对供试材料进行扩增，共检测到48个遗传位点，包含44个多态性位点，多态性位点百分率为91.67%。材料间遗传相似系数为0.29～0.98，平均为0.65。当阈值为0.58时，供试样品可分为3个组，即组Ⅰ、组Ⅱ和组Ⅲ。遗传相似性分析结果显示材料间具有丰富的遗传多样性。

关键词：樱桃；遗传多样性；ISSR

中图分类号：S662.501 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）11-0012-03

樱桃为蔷薇科（Rosacea）李属（Prunus）樱桃组植物，多分布在亚洲和欧洲[1]，全世界樱桃组植物约有120种以上，主要分布于北半球温和地带。中国栽培樱桃已有3000多年的历史。我国栽培的樱桃可分为四大类，即中国樱桃、甜樱桃、酸樱桃和毛樱桃[2]，其中以中国樱桃和甜樱桃为主要栽培对象。我国樱桃种质资源丰富，华北、华中及两广地区皆有分布，尤以浙江、山东、河南、江苏、陕西、四川、安徽、河北分布最多，为充分挖掘樱桃种质资源提供了天然条件[3，4]。

ISSR（Inter-simple sequence repeat） 是Zietkiewitcz等于1994年发展起来的微卫星基础上的分子标记[5]，是一种简单重复序列之间扩增多态性分子标记。其利用基因组中有关SSR序列信息，引物的开发较SSR引物简单，且可以在不同的物种间通用，不像SSR标记一样具有较强的种属特异性。ISSR分子标记不仅具有SSR标记的稳定性且揭示的多态性较RAPD高[6，7]，是一种非常理想的分子标记技术，目前已广泛用于植物品种鉴定、遗传作图、遗传多样性及分子生态学研究。本试验采用ISSR标记技术对山东省部分主栽樱桃品种和砧木资源进行检测，并分析其遗传背景差异，对樱桃资源的科研、生产具有重要的实际应用价值和科学价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用材料均于2014年4月采自山东省果树研究所樱桃品种资源保存圃，所用12份材料均为目前生产上的主要栽培品种。随机采取健康嫩叶迅速于液氮中冷冻，放于-80℃冰箱保存备用。样品编号及品种见表1。

1.2 模板DNA的制备

采用改良CTAB法[8]提取叶片的基因组DNA，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测其质量。稀释DNA至终浓度10 ng/μL，-20℃储存备用。

1.3 ISSR反应

ISSR引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成，筛选出6条用于PCR（表2）。PCR扩增体系为20 μL，其中10 × buffer （含Mg2+） 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，10 μmol/L Primer 1 μL，2.5 U/μL Taq聚合酶0.4 μL，10 ng/μL DNA模板1 μL 和无菌ddH2O 14 μL。PCR 反应程序为95℃ 5 min；95℃ 1 min，48℃ 1 min，72℃ 1 min，35 个循环；72℃ 10 min，程序结束后进入4℃保存。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离检测，于紫外灯下观察，并拍照保存。

1.4 数据统计分析

将所获得的电泳谱带进行数字化统计，按照图谱中同一位置条带的“有”、“无”进行统计，有带标记为“1”，无带标记为“0”，仅记录重复性好、条带清晰且片段为200～750 bp 范围内的扩增带。将DNA扩增带数据输入到数据矩阵，通过NTSYSpc（version 2.11 a）采用非加权类平均法（UPGMA）进行聚类分析建立聚类图，并计算遗传相似系数。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增产物的多态性分析

6条引物均能对12份樱桃种质基因组DNA扩增出清晰稳定的多态性条带，图1为引物ISSR36扩增的带型。本试验共检测到48个遗传位点，其中包含44个多态性遗传位点，多态性位点比率为91.67%（表2）。同一样品的不同引物扩增条带数量和多态性差异较大。

2.2 遗传相似性

12份樱桃种质个体间的相似系数为0.29～0.98，平均值为0.65。其中1与4和2与3的遗传相似系数最大，为0.98，说明其遗传距离最近，即亲缘关系最近，5与10 的遗传相似系数最小，仅为0.29，说明二者遗传相似性最低，亲缘关系最远。

2.3 聚类分析

对供试12份种质进行聚类分析，结果表明，品种间遗传背景有较大的差异，遗传多样性丰富。在相似系数0.58处，12个品种可聚类为3个组（图2），其中，1、4、10、2、3、11和12聚为一个分支，为组Ⅰ；5和9聚为一个分支，为组Ⅱ；6、7和8聚为一个分支，为组Ⅲ。

3 结论

6条ISSR 引物均能有效扩增出多态性条带，说明ISSR标记是樱桃遗传分析的有效工具。供试12个样品间的相似系数分布在0.29～0.98之间，ISSR标记能将供试样品完全区分开。品种间具有丰富的遗传多样性，亲缘关系复杂，遗传背景存在很大差异。物种的地理分布特征也可能影响其遗传多样性水平，一般而言，广泛分布比狭域分布的物种具有更高的遗传多样性[9]，供试樱桃品种间表现出较高遗传多样性，可能与它们地理分布相对较广有关。参 考 文 献：

[1] 俞德浚.中国植物志[M].北京：科学出版社， 1986： 46-87.

[2] 于亚军，代汉萍，李宝江，等. 世界樱桃育种进展[J]. 果树学报，2003，20（2）：135-139.

[3] 胡正刚.中国樱桃的分布及生产现状[J].落叶果树， 1996（3）：29-30.

[4] Li M M，Cai Y L，Qian Z Q， et al. Genetic diversity and differentiation in Chinese sour cherry Prunus pseudocerasus Lindl.， and its implications for conservation[J]. Genetic Resources and Crop Evolution， 2009， 56（4）： 455-464.

[5] Zietkiewicz E， Rafalski A， Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics， 1994， 20： 176-183.

[6] Sanchez de la Hoz M P，Davila J A，Loarce Y，et al. Simple sequence repeat primers used in polymerase chain reaction amplifications to study genetic diversity in barley [J]. Genome， 1996， 39（1）： 112-117.

[7] Ratnaparkhe M B，Santra D K，Tullu A，et al. Inheritance of inter-simple-sequence-repeat polymorphisms and linkage with a fusarium wilt resistance gene in chickpea [J].Theor. Appl. Genet.， 1998， 96（3/4）： 348-353.

[8] 陈新.榛子花芽转录组文库的Solexa 测序及冷调节基因的表达谱分析[D].北京：中国林业科学研究院，2011.

[9] Nybom H， Bartish I V. Effects of life history traits and sampling strategies on genetic diversity estimates obtained with RAPD markers in plants [J]. Perspectives in Plant Ecology， Evolution and Systematics， 2000， 3（2）：93-114.