唐 悦，轩小燕，柳璐璐，李 敏

郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室 郑州450001

#通讯作者，女，1975年1月生，博士，副教授，研究方向:食管癌防治，E-mail:liminzzu@gmail.com

食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤的2%。化疗是肿瘤患者(包括术后患者)的主要治疗手段之一。化疗耐药尤其是对最常用的铂类化疗药物的耐药限制了化疗药物的治疗效果，也是引起肿瘤化疗失败及复发的主要原因［1-2］，因此逆转化疗耐药的研究成为所有问题的焦点。谷胱甘肽S 转移酶(glutathione S-transferase，GST)是一组具有复杂生理功能的蛋白质，主要参与机体的解毒［3］。近年来其亚型GST-π 成为肿瘤化疗耐药研究的新热点［4-6］。作者前期的研究［7-8］表明人食管鳞状细胞癌顺铂耐药细胞系EC9706/cDDP 细胞中GST-π 的表达明显增加，说明GST-π 与食管癌细胞的顺铂耐药性有一定关系。为进一步研究GST-π 基 因 在 多 药 耐 药(multidrug resistence，MDR)形成中的作用及探索有效的MDR 逆转方法，作者构建了靶向GST-π 基因的siRNA 重组慢病毒，转染EC9706/cDDP 细胞，观察细胞对化疗药物敏感性的改变，探讨沉默GST-π 的表达是否会在一定程度上逆转EC9706/cDDP 的顺铂耐药性。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂 高分化EC9706/cDDP 细胞由郑州大学基础医学院李敏老师的研究团队保存。EC9706、慢病毒包装细胞293FT、大肠杆菌DH5α 和pRNAT-U6.2/Lenti 表达载体为郑州大学微生物学与免疫学教研室保存。RPMI 1640 培养液购自美国Gibco 公司。ViraPowerTM慢病毒包装混合物(经优化的包含3 种包装质粒的混合物)、转染试剂LipofectamineTM2000 购自美国Invitrogen 公司。胶回收试剂盒及小量质粒提取试剂盒购自Axygen 公司。兔抗人GST-π 抗体、羊抗兔多克隆抗体及TRITC 标记的羊抗兔抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。编码发卡样RNA 的寡核苷酸及相关引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 siRNA 的设计与合成根据 GenBank BT019950 GST-π mRNA 序列，应用Ambion siRNA靶序列分析设计系统，针对靶基因序列设计多个RNA 干扰(RNAi)靶点序列，最终确定2 个长为19 bp 的靶序列:5'-GACCTCCGCTGCAAATACA-3'(295～313 位点)、5'-GAGGCAAGACCTTCATTGT-3'(416～434 位点)。设计分别针对这2 个靶序列的2对编码短发卡RNA 的寡核苷酸序列(第一对为GST11、GST12;第二对为GST21、GST22)，同时依据这2 个靶位点的碱基组成，随机组合出一条无关对照寡核苷酸序列5'-TACGCTGACTTGATTGTTC-3'，针对该序列的编码短发卡RNA 的寡核苷酸序列为GSTC1、GSTC2。

1.3 siRNA 慢病毒表达载体的制备与鉴定 用BamHⅠ/XhoⅠ双酶切pRNAT-U6.2/Lenti 载体，与设计合成的GST-π siRNA 模板寡核苷酸胶回收产物连接后转化到DH5α 感受态细菌中，阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。成功得到3 种siRNA 慢病毒表达载体:pRNAT-U6.2/LentisiGST1、pRNAT-U6.2/Lenti-siGST2、pRNAT-U6.2/Lenti-siGSTC。

1.4 慢病毒包装 将ViraPowerTM慢病毒包装混合物和siRNA 慢病毒表达载体(pRNAT-U 6.2/LentisiGST1、pRNAT-U6.2/Lenti-siGST2 或pRNAT-U6.2/Lenti-siGSTC)转染至293FT 细胞，置CO2培养箱，37℃孵育过夜后更换为含1 mol/L 丙酮酸钠的完全培养基培养。转染48～72 h 后将含病毒的上清液移至15 mL 无菌锥形管，4℃3 000 r/min 离心5 min，除去细胞碎片。210 000 g 离心90 min，弃上清，450 μL PBS 重悬。3 种病毒分别命名为GSTsi1、GSTsi2 和GSTsiC。吸取病毒悬液至冷冻管分装，－80℃保存。

1.5 病毒滴度测定 将293FT 细胞按2×105个/孔接种至6 孔板中，24 h 后取病毒GSTsi1、GSTsi2和GSTsiC 悬液作不同比例稀释(1 ∶103～1∶1010)，按每孔400 μL 加至细胞培养板中，37℃培养4～6 h。换新鲜培养基，继续培养24 h，荧光显微镜下观察，病毒滴度参照文献［9］的方法计算。

1.6 免疫荧光实验 EC9706/cDDP 细胞接种24 h后，按细胞与病毒数1∶10 的比例加入GSTsi2 病毒稀释液，将细胞用40 g/L 多聚甲醛固定、体积分数为20%正常山羊血清封闭后，加一抗(兔抗人GSTπ 抗体)4℃孵育过夜，PBS 冲洗3 次后加二抗(TRITC 标记的羊抗兔抗体)。暗环境37℃条件下孵育2 h，冲洗后用水溶性封片剂封片。

1.7 GST-π mRNA 和蛋白表达的检测 分别用相关基因引物进行半定量RT-PCR，以β-actin 作内参。PCR 反应体系含:10× Buffer 3.0 μL，Taq 酶0.15 μL，dNTP 2.4 μL，上、下游引物各1.0 μL，模板2.0 μL。PCR 反应条件:94℃5 min 预变性;94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，35 个循环;72℃延伸5 min。GST-π mRNA 的相对表达量以目的基因与内参条带灰度值的比值表示。Western blot法检测GST-π 蛋白的表达。取50 μg 蛋白样品进行SDS-PAGE 电泳，电泳后利用电印记法将凝胶中的蛋白质转移到PVDF 膜上。将含50 g/L 脱脂奶粉且TBS 封闭后的PVDF 膜置于封闭液稀释的兔抗人GST-π 一抗中，室温摇床振荡1 h，取出漂洗;再加入用封闭液稀释的羊抗兔多克隆抗体中，室温摇床振荡1 h，取出漂洗。用ECL 试剂化学发光、显影。

1.8 MTT 法检测细胞对顺铂耐药敏感性的变化取GSTsi2、GSTsiC 感染和未感染的EC9706/cDDP对数生长期细胞，以3×104mL－1细胞浓度接种于96 孔培养板，200 μL/孔。24 h 后更换含不同终浓度顺铂的培养液，每一浓度重复4 孔，并设不含药的空白对照孔。48 h 后加入5 g/L MTT 20 μL/孔，继续培养4 h 后，加入二甲基亚砜(DMSO)200 μL/孔，充分混匀，以波长550 nm 测各孔吸光度(A)值。同时检测亲本EC9706 细胞。增殖抑制率=(1 －加药孔A 值/对照孔A 值)×100%。计算IC50。耐药指数(RI)=实验细胞IC50/亲本细胞IC50。

1.9 统计学处理 采用SPSS 17.0 软件对数据进行处理分析。各组细胞GST-π mRNA 表达和RI 差异的比较采用单因素方差分析及SNK-q 检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 siRNA 慢病毒表达载体的鉴定结果 重组质粒的PCR 鉴定结果见图1。阳性克隆测序结果与设计序列完全一致。

图1 重组质粒的PCR 鉴定结果

2.2 病毒滴度的测定结果 经测定，GSTsi1、GSTsi2 和GSTsiC 的病毒滴度均可用于后续的细胞感染。病毒感染EC9706/cDDP 细胞48 h 后在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达，随时间的延长表达增强。细胞的感染率较高，几乎所有细胞均被感染。慢病毒感染过的细胞上清液收集后用于新的EC9706/cDDP 细胞培养，48 h 后未见有荧光，表明慢病毒感染细胞后的上清没有感染性，安全性较高。

2.3 各组细胞中GST-π mRNA 和蛋白表达的比较 见表1、图2。

表1 各组细胞中GST-π mRNA 的表达(n=4)

图2 各组细胞中GST-π蛋白的表达

2.4 各组细胞对顺铂耐药敏感性的变化 见表2。

表2 各组细胞的RI 比较(n=4)

2.5 免疫荧光实验结果 免疫荧光实验结果见图3。GSTsi2 干扰后在荧光显微镜下发红色荧光的EC9706/cDPP 细胞数目少且荧光很弱，表明GSTsi2可有效抑制细胞内GST-π 基因的表达。

图3 免疫荧光实验结果(×100)

3 讨论

GST 广泛分布于人的正常组织，与恶性肿瘤的关系密切，是肿瘤细胞耐药的标志之一。Tew 等［9］对于肿瘤细胞株的研究发现，GST-π 参与了细胞对顺铂、阿霉素以及丝裂霉素C 耐药的产生。张帆等［10］发现术前未经治疗的卵巢癌在一定程度上存在着由GST-π 介导的内在性的耐药机制，GST-π 的表达能较好地预测化疗反应。

近年来对MDR 逆转的研究有较大进展。随着科研人员对GST 的结构和生物学功能的深入研究，一些以GST 为靶点的肿瘤MDR 逆转剂被发现。Yu等［11］的研究表明色胺酮可以抑制MCF-7 细胞株的GST 活性并且降低GST-π 的表达。在已有的逆转MDR 的反义基因治疗技术中，常用的是反义寡核苷酸和核酶，它们特异性地作用于MDR 基因，使其转录和翻译过程受阻，从而达到逆转MDR 的目的。Ban 等［12］发现针对GST-π 基因的反义cDNA 转染能够引起肿瘤细胞对包括顺铂、阿霉素在内的多种抗肿瘤药物的敏感性增强。RNAi 是dsRNA 介导的转录后基因沉默，具有高效性、高度特异性和可遗传性，是一种新兴的基因治疗技术。以特异性短发卡RNA 介导的RNAi 技术为逆转肿瘤细胞MDR 的治疗开创了新的思路［13-16］。应用siRNA 克服食管癌治疗中对顺铂的耐药，不仅将提高肿瘤的化疗效果，减少化疗药物的用量，降低化疗药物的毒副作用，而且对克服其他肿瘤中的MDR 现象也有借鉴意义。

课题组前期研究提示 GST-π 很可能在EC9706/cDDP MDR 的形成中起一定作用(待发表)。为了明确GST-π 基因沉默是否会在一定程度上逆转肿瘤细胞的耐药性，该实验用靶向GST-π 的siRNA 重组慢病毒GSTsi1、GSTsi2 感染EC9706/cDDP。结果显示RNAi 策略可下调EC9706/cDDP 细胞GST-π mRNA 的相对表达水平，GST-π 蛋白表达也减弱。作者选择干扰能力更强的GSTsi2 感染EC9706/cDDP 细胞，结果显示该细胞对顺铂的RI下降。以上结果表明GST-π 的表达与肿瘤细胞的耐药性相关，RNAi 技术可逆转肿瘤细胞的耐药性，这为应用siRNA 逆转肿瘤耐药提供了可行依据，并为寻找有效的食管癌临床化疗方案提供了参考。

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