刘金娜，刘铭，杨太新，贾东升，温春秀，谢晓亮，*，田伟，刘玲娣

（1.河北农业大学农学院，河北保定071000；2.河北省农林科学院经济作物研究所，河北石家庄050051）

栝楼系葫芦科（Cucurbitaceae）植物，其入药部位较多，《中国药典》已将栝楼Trichosanthes kirilowii Maxim.和双边栝楼Trichosanthes rosthornii Harms的种子、果实、果皮及根分别药用，习称瓜蒌子、全瓜蒌、瓜蒌皮及天花粉[1]。栝楼富含油脂类、甾醇类、三萜类、黄酮苷类及蛋白质等多种化学成分，具有改善心血管系统功能、祛痰止咳、抗菌、抗溃疡、抗肿瘤及泻下等生物活性[2]。药理实验又表明发挥化痰止咳作用的物质与其所含的半胱氨酸、天门冬氨酸和蛋氨酸有关，蛋白质作为生命活动的体现者，转化成小分子氨基酸才能被动植物所利用，因而蛋白的含量在一定程度上可反映氨基酸来源的多少。因此有必要对栝楼各药用部位的蛋白含量进行测定分析。

近年来栝楼的研究多侧重在各入药部位具体化学成分的比较分析上，瓜蒌子中3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇、α-菠菜甾醇含量的比较分析及瓜蒌籽油脂特性的分析[3-5]；瓜蒌皮中挥发性成分、有机酸的测定及叶黄素提取工艺的研究[6]；天花粉中葫芦素B的提取及含量测定等方面多见报道[7]，有关粗蛋白在栝楼各药用部位的分布情况及不同种之间的含量比较上报道甚少。

本试验将搜集到的13个不同居群的栝楼资源集中种植统一管理，除了环境因子的影响，在同一水平上分别对不同居群的瓜蒌子、瓜蒌皮及天花粉中蛋白的含量进行了测定，探明了粗蛋白在栝楼各药用部位的分布情况，明确了以粗蛋白为评价标准的最优栝楼种质，为合理开发利用栝楼资源及品种选育提供参考。

1 材料

1.1 试剂

硫酸铵；Brij- 3530%溶液；硫酸钾；氢氧化钠；磷酸氢二钠；次氯酸钠；硝普钠；酒石酸钾钠；水杨酸钠；蒸馏水。

1.2 仪器与材料

AA3型流动分析仪：荷兰SKALAR公司；AX504分析天平：瑞士梅特勒公司；TDL80-2B离心机：上海安亭科学仪器厂。

本实验所用瓜蒌子、瓜蒌皮及天花粉均由河北省农林科学院经济作物研究所提供。

2 方法

2.1 蛋白质含量的测定方法

2.1.1 溶液的制备

缓冲液的配置：取磷酸氢二钠35.8 g、氢氧化钠32 g和酒石酸钾钠50 g精密称定，分别加入重蒸水溶解，后稀释定容至 1000 mL。混合均匀后再加入2 mL Brij- 3530%溶液。

水杨酸钠溶液的配制：取水杨酸钠40 g，精密称定，溶于600 mL蒸馏水中，加入1 g硝普钠，稀释定容止至 1000 mL。溶液混均备用。

次氯酸钠溶液的配制：加入3 mL次氯酸钠溶液至60 mL水中。再稀释至100 mL，混合均匀备用。

进样器清洗液的配制：加入40 mL硫酸至600 mL水中，待冷却后稀释定容至 1000 mL。

2.1.2 标准曲线的制备

取4.717 g硫酸铵精密称定，加蒸馏水溶解稀释至1L制成标准液A备用，量取上述标准液A5mL，加蒸馏水稀释至100mL，配置成每升含氮50mg的标准液B。

精密吸取标准液 B 0、5、7.5、10、12.5、15、20、30 mL，分别置于50 mL容量瓶中，660 nm下采用流动分析仪进行分析测定。以峰高A为纵坐标，氨氮的浓度c为横坐标，绘制标准曲线。所得线性方程为：A=0. 9897c+0. 0672，R2=0. 9986，结果表明氨氮浓度在0～30 mg/L范围内线性关系良好。

2.2 供试品溶液的制备

取药材粉末（过40目筛子）约0.2 g，精密称定，置于消煮管中，向其中加入8 mL的浓硫酸，320℃下消煮至溶液变为澄清，其间每隔30 min加入适量双氧水。待消煮液冷却至室温时，向其中依次加入适量的蒸馏水，摇匀静置，冷却后过滤，再加水稀释至50 mL容量瓶内，备用。

2.3 蛋白含量的测定

采用浓硫酸-双氧水消煮法，将植物体内各种形态的氮转化成铵态氮进入无机相，硝普钠用做催化剂，与水杨酸钠及次氯酸钠发生反应生成一种蓝色化合物，可在660 nm处测定。

精密量取上述供试品溶液0.5 mL，加水稀释10倍，采用流动分析法和国家标准方法，660 nm下比色分析，测得吸光值A，根据2.1.2项下标准曲线的制备计算其蛋白含量。

2.4 数据处理

数据分析采用SPSS 17.0，组间比较采用t检验。

3 结果

3.1 不同居群栝楼间各药用部位蛋白的含量

不同居群栝楼间各药用部位蛋白的含量，见表1。

表1可见，不同种质栝楼间各药用部位蛋白含量具有一定的差异性，籽中蛋白含量最高的种质来源于河南安阳文峰区，其含量最高可达（69.758±0. 0327）mg/g，果皮中蛋白含量最高属山西侯马为（93.443±0. 0398）mg/g，根中蛋白含量最高达（51.076±0. 0550）mg/g来自于河北安国。

表1 不同居群栝楼各药用部位蛋白含量（mg/g，n=3）Table 1 Medicinal parts of protein content in different group of Trichosanthes kirilowii

3.2 不同地域栝楼间各药用部位蛋白含量的比较分析

不同地域栝楼间各药用部位蛋白含量的比较分析，见表2。

表2 不同地域栝楼间各药用部位蛋白含量比较分析（mg/g，n=3）Table 2 Medicinal parts of protein content in different area of Trichosanthes kirilowii

将同一省份内的不同栝楼居群各入药部位的蛋白含量进行合并，由表2知，不同省份栝楼中蛋白含量差异显著，其中山西、河南地区蛋白含量差异不明显，但与其他3省差异达显著水平，安徽地区蛋白含量最低；瓜蒌子、瓜蒌皮及天花粉不同地域之间蛋白含量亦差异显著，其中河南地区瓜蒌子中蛋白的含量最高且显著高于其他四省，山东、河北、山西地区瓜蒌子中蛋白的含量差异不明显；山西地区瓜蒌皮中蛋白含量最高，其次为河南、山东、河北，安徽地区蛋白含量最低；河北地区天花粉中蛋白达到最大值，显著高于山东、安徽、山西、河南四省。

3.3 各药用部位蛋白含量的比较分析

栝楼各药用部位蛋白含量均差异显著，其中来自河北、山东、安徽的栝楼资源，其种子中蛋白含量显著高于皮和根；山西、河南的栝楼种质，其皮部蛋白最高，其次为子，根部最低，见图1。

图1 栝楼各药用部位蛋白含量的比较Fig.1 Comparation of protein content in different medicinal parts of Trichosanthes kirilowii

4 结论与讨论

连续流动分析仪是近年来发展起来的一种分析技术，可将繁琐的手工比色付诸于自动的仪器操作，并能使所有的样品在同等的条件下发生反应，再通过检测器将信号传入电脑进行数据分析，同时减小了手工操作和条件差异产生的误差，具有灵敏、快速高效、省时省力省试剂、污染小等优点已经广泛应用于环境监测、医药、化工分析等领域。本试验采用了该方法对河北、山东、安徽、河南、山西5省共13份栝楼资源各药用部位中的蛋白含量进行测定，结果表明不同药用部位蛋白含量差异显著，不同地域之间其蛋白含量亦差异显著，其中河南安阳一带的栝楼种质其种子中蛋白含量最高为（69.758±0. 0327）mg/g，以蛋白含量为考评指标，供药食两用具有较高的营养价值，山西侯马一带的瓜蒌皮中的蛋白含量最高为（93.443±0. 0398）mg/g，河北安国一带的天花粉中蛋白含量最高为（51.076±0. 0550）mg/g，因此根据市场需求及收获目的的不同，可选择最优的种质资源田间栽培以期获得较高的经济效益。

整体分析可知，山西、河南一带的栝楼资源引种于河北石家庄，其总蛋白含量较安徽高，山东居中，这可能与南北气候差异较大有关，一般相同纬度下引种较容易，然而山西侯马、绛县、新绛以及河南安阳，其纬度与石家庄最为接近，受环境影响较小，加之河南安阳一带是全国栝楼的主产区之一，栝楼种质较优，其含量相对较高，安徽隶属南方，南北气候差异较大，引种不易，其蛋白含量较低在很大程度上与不适应的气候有关。

本实验的材料均播种在同一生长环境下，同样的栽培条件其蛋白含量亦差异显著，多年种植后，这种差异会趋于一致但仍存在一定的差异性。环境在一定程度上会影响植物体内物质组成的改变，但不能起到决定性的作用，基因型的改变才会引起质的变化。优质的中药材不仅产量要高，其能发挥药效的物质的含量也应该较高。然而通过转基因的方法获得的中药种质，虽然产量增加了但是发挥药效的物质的含量并没有增加，可能还有减少的趋势，甚者还会产生未知的新物质，影响药材的配伍及药效的发挥，具有一定的风险性，因此药材优质种质的选育宜从栽培条件的优化和常规育种方法着手。优质的药材种质种植在不适宜生长的环境下，其发挥药效成分的物质会慢慢减少，甚者长时间种植会不及普通的种质资源，而普通的种质种植在最适宜的环境下，其药效含量会有上升的趋势，然而优质的种质在其最适宜的环境下生长所收获的药材，其质优，稳定，疗效可靠，可以称之为道地药材。因此对中药材道地性的研究宜为中药材优质种质选育的手段之一，必要时结合常规杂交育种方式，以期为中药优质种质选育提供新思路。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京：中国医药科技出版社,2010：104

[2] 刘金娜,温春秀,刘铭,等.瓜蒌的化学成分和药理活性研究进展[J].中药材,2013,36(5)：843-848

[3] 闫永婷,何家庆,黄训端,等.栝楼籽油的理化性质及其脂肪酸组成分析[J].中国林副特产,2008,96(5)：29-31

[4] 时岩鹏,姚庆强,刘拥军,等.栝楼化学成分的研究及其α-菠菜甾醇的含量测定[J].中草药,2002,33(1)：14-16

[5] 程雪梅,吴弢,俞桂新,等.RP-HPLC法测定瓜萎子中3,29-二苯甲酰基括楼仁三醇含量[J].药物分析杂志,2005,25(4)：377-380

[6] 马志虎,侯喜林,陈红霞,等.栝楼皮叶黄素的超临界CO2萃取及其稳定性研究[J].精细化工,2009,26(12)：1215-1219

[7] 周涛,黄璐琦,江维克,等.高效液相色谱法测定大方油栝楼药材中葫芦素B的含量[J].中国实验方剂学杂志,2008,14(6)：4-5