王 萍，胥 冰，张丽君(陕西中医学院免疫教研室，咸阳 712046;通讯作者，E-mail:smilewangping@163.com)

丙型肝炎是一种由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染机体后所引起的传染性疾病，全世界约2亿人为HCV感染者，且其中80%感染者为慢性持续感染者，慢性丙型肝炎是引起肝硬化、原发性肝癌重要原因之一。研究证实调节性 T细胞(regulatory T cell，Treg)具有免疫无能和免疫抑制两大功能，在诱导和维持免疫耐受过程中发挥重要作用［1，2］。国内外研究发现 Treg 细胞在 HBV、HCV、HIV等病毒感染性疾病中发挥一定作用［3］。为进一步研究Treg细胞在慢性丙型肝炎中的作用，本研究拟通过对慢性丙型肝炎患者外周血CD4+Foxp3+Treg细胞、核转录因子Foxp3及转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的检测，初步探讨Treg细胞在慢性丙型肝炎中的变化及其意义。

1 资料和方法

1.1 研究对象

选择2012-06～2013-03在陕西中医学院附属医院住院和门诊治疗的慢性丙型肝炎患者60例，其中男性36例，女性24例，年龄20-63岁，平均年龄(37.19±14.07)岁。诊断标准符合2000年中华医学会传染病与寄生虫学分会、肝病学分会联合修订的《病毒性肝炎防治方案》［4］，排除标准:排除甲、乙、丁、戊型肝炎及其他病毒性疾病、自身免疫性、恶性肿瘤、药物及酒精性肝炎及严重心肾内分泌疾病等。同期在陕西中医学院附属医院进行体检的40例健康体检者作为正常对照组，其中男性22例，女性18 例，年龄18-60 岁，平均年龄(35.67 ±12.39)岁，均排除病毒性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤和药物及酒精性肝炎。两组研究对象在性别(χ2=0.246，P=0.619)、年龄(t=0.554，P=0.580)上的差异均无统计学意义(P＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 CD4+Foxp3+Treg细胞检测 采用流式细胞术检测CD4+Foxp3+Treg细胞，利用人淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，并调整细胞浓度为1×106个/ml。500 μl单细胞悬液加入 20 μl FITCCD4抗体，混匀后避光孵育20 min;洗涤离心后分别加入4℃ 1×固定液、37℃ 1×破膜液后洗涤重悬细胞后，加入20 μl PE-Foxp3或同型对照抗体，孵育30 min后洗涤重悬细胞。应用FACS Calibur型流式细胞仪进行检测，通过Cellquest软件进行收集分析数据。

1.2.2 Foxp3 mRNA表达水平检测 采用实时定量逆转录聚合酶链反应检测Foxp3 mRNA表达水平，取 500 μl单细胞悬液，加入 1.0 ml TRIzol液提取外周血单个核细胞总RNA，利用cDNA第一链合成试剂盒进行第一链合成，以上操作均严格按照试剂盒说明书进行。根据文献合成 Foxp3及内参GAPDH 引物［5］，20 μl PCR 反应体系如下:SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(2 × )10 μl、PCR 上下游引物(2 μmol/L)各 2 μl、cDNA 6 μl。扩增条件为:95 ℃ 10 s预变性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共45个循环。扩增结束采用2-ΔΔCt分析Foxp3 mRNA基因的相对表达。

1.2.3 血浆中TGF-β1水平检测 无菌采集静脉血2.0 ml，1 500 r/min 离心 10 min 分离血浆，采用酶联免疫试吸附试剂盒检测血浆中TGF-β1水平，每个样本设置3个复孔。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 慢性丙型肝炎患者外周血CD4+Foxp3+Treg细胞百分率变化

流式细胞分析(以CD4+细胞为门)结果显示慢性丙型肝炎患者外周血CD4+Foxp3+Treg细胞百分率与正常对照组相比明显升高，差异有统计学意义(P ＜0.05，见图 1、表1)。

图1 慢性丙型肝炎患者外周血CD4+Foxp3+Treg细胞百分率变化Figure 1 The changes of CD4+Foxp3+Treg cells in the peripheral blood of patients with chronic hepatitis C by flow cytometry

2.2 慢性丙型肝炎患者外周血Foxp3 mRNA表达水平变化

荧光定量PCR检测Foxp3 mRNA表达水平结果显示:与正常对照组相比，慢性丙型肝炎患者外周血Foxp3 mRNA表达水平明显升高，差异有统计学意义(P ＜0.05，见表1)。

2.3 慢性丙型肝炎患者血浆中TGF-β1浓度变化

慢性丙型肝炎患者血浆TGF-β1水平明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P＜0.05，见表1)。

表1 两组研究对象外周血中CD4+Foxp3+Treg细胞、Foxp3 mRNA、TGF-β1水平的比较Table 1 Com parison of the levels of CD4+Foxp3+Treg cells，Foxp3 mRNA and TGF-β1 in the peripheral b lood of patients with chronic hepatitis C between two groups

3 讨论

HCV 感染机体后可以诱导机体产生体液免疫和细胞免疫应答，但体液免疫不能有效地清除病毒。随着对丙型肝炎发病机制研究的不断深入，目前普遍认为丙型肝炎病毒造成的肝脏损伤及转归与机体细胞免疫功能及免疫耐受密切相关。机体免疫功能异常，不能清除HCV，导致病毒长期存在形成慢性感染。研究证实慢性丙型肝炎患者体内HCV特异的CD8+和CD4+T细胞反应活性降低，国内外研究显示调节性T细胞在慢性丙型肝炎的进展中起到重要的作用［6-10］。

自从1995年日本学者 Sakaguchi等［11］发现调节性T细胞以来，随着研究深入认为调节性T细胞是一群独立的细胞，Treg细胞在自身免疫性疾病、肿瘤、移植及感染性疾病中发挥重要作用［1，2］。最近研究证实Treg细胞在HCV感染中也发挥一定作用［6-10］，但研究结果并不完全一致，可能与每个研究的病例选择、采样时间、Treg细胞检测分选手段不同等因素有关。目前普遍认为Foxp3是Treg细胞分化过程中关键的转录激活因子［12］，因此我们利用CD4+Foxp3+作为检测Treg细胞的标记。而Treg细胞主要通过分泌 TGF-β1来发挥作用效应［2］，我们同时检测了HCV患者血浆中TGF-β1的水平。实验结果显示慢性丙型肝炎患者CD4+Foxp3+Treg细胞百分率、Foxp3 mRNA及血浆TGF-β1水平与正常对照组相比均明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，这与国内外的研究结果基本一致［5-9］。研究证实Treg细胞具有免疫抑制性和免疫无能性功能，其发挥抑制作用的靶细胞不区分CD4+和CD8+T细胞。在慢性丙型肝炎患者体内CD4+Foxp3+Treg细胞增多，抑制了HCV特异性CD8+T细胞功能，不能完全清除HCV，使病毒长期存在，造成慢性感染。

综上所述，慢性丙型肝炎患者体内 CD4+Foxp3+Treg细胞及血浆TGF-β1水平增高，发挥了免疫抑制作用，减弱HCV特异性CD8+T淋巴细胞反应，病毒无法清除，造成 HCV慢性感染。但CD4+Foxp3+Treg细胞发挥抑制作用的信号分子及信号传递通路尚未完全清楚，深入研究 CD4+Foxp3+Treg细胞与慢性丙型肝炎的关系，可能为阐明丙型肝炎的慢性化机制及指导其治疗提供理论及实验基础。

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