尚啸+王健+龚胜+张珂+孙海燕

摘要：以三色堇（Viola tricolor L.）叶片为材料，采用SDS法、CTAB法及改良CTAB法分别对三色堇叶片DNA进行了提取，并用琼脂糖凝胶电泳和紫外光谱对DNA提取质量和浓度进行检测。结果表明，改良CTAB法提取的DNA纯度最高，提取效率较高;SDS法提取的DNA含有较多的蛋白质或糖类杂质;CTAB法虽然能够除去蛋白质等杂质，但是DNA浓度低于改良CTAB法。

关键词：三色堇（Viola tricolor L.）;叶片;产率;纯度

中图分类号：Q78        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）20-4999-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.063

DNA Extracting from Viola tricolor L. Leaves

SHANG Xiao， WANG Jian，GONG Sheng，ZHANG Ke，SUN Hai-yan

（Key Laboratory of Protection， Development and Μtilization of Tropical Crop Germplasm Resources of Ministry of Education/College of Horticulture and Landscape， Hainan Μniversity， Haikou  570228，China）

Abstract： High-quality DNA sample is important for plant molecular study. DNA was extracted from Viola tricolor L. leaves with SDS， CTAB and modified CTAB. The quality and concentration of extracted DNA was detected by agarose gel electrophoresis and ultraviolet spectrum. The results showed that the purity of DNA extracted with modified CTAB method was the best. DNA extracted with SDS method contained more impurities including protein or carbohydrate. Although CTAB method removed proteins， DNA concentration was lower than that with the modified CTAB method. The modified CTAB method was an appropriate， rapid and practical way for extracting DNA from Viola tricolor L. leaves.

Key words： Viola tricolor L.; leaves; productivity;purity

三色堇（Viola tricolor L.）属堇菜科（Violaceae）堇菜属（Viola），又称猫脸花、猫儿脸、鬼脸花，原产于欧洲，为一二年生花卉，性喜温凉，我国各地均有栽培。三色堇品种繁多，色彩鲜艳，花期长且耐寒，有“花坛皇后”的美誉，深受人们喜爱[1]。三色堇的花色丰富多彩，有白色、黄色、粉红色、红色、淡紫色、紫色、杏黄色和橙色等;单朵花有纯色花和复色花两类，花瓣还常带有条纹、花斑、花边等。三色堇是我国重要的花坛和盆栽花卉，且市场需求量大，国内外关于三色堇的研究主要集中于其引种栽培研究和杂交育种工作上[2]。自18世纪40年代培育出具色斑的类型以来，三色堇的育种工作也得到了发展，但是关于其分子生物学方面的研究还较少。

高质量的DNA是进行分子生物学研究的必要前提，SDS、CTAB法及其改良方法等是常用的植物DNA提取方法[3]。三色堇叶片DNA提取方法已有报道[4]，但是总体来看，提取过程比较繁琐，提取效率比较低，需时较长，尚不能满足快速大量提取DNA用于分子生物学研究的要求。本研究根据前期试验研究，以三色堇叶片为试验材料，研究了不同方法提取三色堇总DNA的提取效果，为三色堇分子水平研究提供技术支持。

1  材料与方法

1.1  试验材料

三色堇种植于自海南大学园艺园林基地，选用茎顶端新鲜嫩叶，立即投入液氮冷冻处理，然后放入-70 ℃冰箱待用。

1.2  方法

1.2.1  不同方法三色堇提取DNA  取备用的三色堇嫩叶，用液氮充分研磨后分别称取0.2 g粉末于2 mL离心管中，分别采用CTAB法、改良CTAB法、SDS法对样品进行抽提，提取的DNA均溶解于100 μL TE中，每个方法取3个样品做重复。

1）CTAB法：操作参考文献[5]。

2）改良CTAB法：将液氮研磨好的嫩叶0.2 g转移至2 mL离心管中，并加入1 mL STE缓冲液，混匀静置5 min后5 000 r/min离心5min。弃上清后加入预热的1 mL 2% CTAB缓冲液裂解释放DNA，并加入15 μL的β-巯基乙醇，65 ℃水浴1 h，每隔10 min振荡以便充分裂解，然后8 000 r/min离心10 min;取上清，加等体积氯仿/异戊醇（24∶1）进行抽提，轻微振荡、混匀;10 ℃下10 000 r/min离心10 min，吸取上清液，重复1～3次。加入1/10体积的3 mol/L NaAc和两倍体积无水乙醇，晾干，用无水乙醇洗涤后吹干，溶于100 μL TE中。endprint

3）SDS法：见参考文献[6]。

1.2.2  DNA质量检测  取5 μL DNA样品以1%的琼脂糖凝胶进行电泳，同时紫外分光光度计测定A230 nm、A260 nm、A280 nm。

1.2.3  PCR扩增检测  根据文献[1]设计了三色堇actin基因特异性引物（正向5′-CAGTGGTCGTACAACTGGTAT-3′;反向5′-ATCCTCCAATCCAGACACTGT-3′）。以改良CTAB法提取的DNA作为模板，PCR检测提取DNA质量。PCR反应体系为：DNA模板3 μL，10×PCR Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl2 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，上、下游引物各4 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL） 0.8 μL，无菌水补足至50 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，36个循环;最后72 ℃延伸10 min。

2  结果与分析

2.1  不同提取方法提取DNA的电泳检测

由图1可知，CTAB法和改良CTAB法提取的DNA上样孔中几乎无残留物，杂质少，条带清晰。CTAB法能够将蛋白质、多糖及一些带正电荷的杂质去除，提取到较纯的DNA。改良CTAB法提取的DNA条带更清晰，提取的DNA质量更高。而SDS法上样孔中残留杂质较多，而且有轻微的拖尾现象，表明提取的DNA中含有糖类和蛋白质，杂质较多，且有轻微的降解。从提取时间上来看，改良CTAB法提取时间约3 h，且在沉淀DNA过程中不需要置于-20 ℃，操作比较简单，而SDS法和CTAB法均需约5～7 h，提取步骤比较繁琐，效率较低。

2.2  产率及纯度检测

由表1可以看出，改良CTAB法提取DNA的A260 nm/A280 nm在1.8～2.0之间，表明DNA无蛋白质和RNA污染，DNA纯度高，提取效果较好。SDS法提取DNA的A260 nm/A280 nm在1.2～1.5之间，表明DNA中有杂质的影响，这与DNA凝胶电泳结果一致。CTAB法提取DNA的A260 nm/A280 nm大于2.0，表明有RNA残留。同时，改良CTAB法提取DNA的A260 nm/A230 nm大于2.0，说明该法所得DNA糖类、盐类或有机溶剂少，纯度较高。同时，从表1还可以看出，改良CTAB法提取的DNA浓度明显大于另外两种方法，DNA产率较高。因此，改良CTAB法更适合于三色堇叶片DNA的提取。

2.3  PCR检测结果

通过PCR扩增得到一条约1 kb明亮清晰的PCR产物（图2），表明改良CTAB法提取的DNA能用于后期的PCR分子生物学试验。

3  结论与讨论

植物基因组DNA的提取方法很多，最常见的提取方法是CTAB法和SDS法[7，8]。SDS和CTAB都是一类去污剂，其作用是破坏细胞膜释放DNA。这两种方法对多数植物基因组DNA的提取均比较有效[9-11]。但对某些特定植物，或不同的器官部位，提取效果有明显差异，有的适宜用SDS法，有的适宜用CTAB法。不同植物因其特点不同，所提取效果也有差异。余晓丽等[12]以黄刺玫的嫩叶为材料，比较了改良SDS法、CTAB法等对其基因组DNA的提取效果。结果表明，改良SDS法可有效控制材料的褐变及DNA污染，提取的DNA纯度和产率均较高。赵喜华等[13]用SDS法提取杜鹃属基因组DNA时，DNA沉淀为淡黄色，纯度过低。SDS法可能是对多糖及次生代谢物含量较高植物的DNA提取效果不理想[14]。而本试验中可能是三色堇含有较多的多糖及次生代谢物，用SDS法提取的DNA浓度不高，并且带有颜色，DNA凝胶电泳后，点样孔很亮，可能是DNA中残留有较多的蛋白质及多糖等杂质，SDS法提取步骤相对繁琐且耗时长。

CTAB法通过改变盐浓度选择性地沉淀DNA，可早期去除色素、多糖类杂质，避免DNA与其共沉淀后再难分离而得到较纯的DNA[15]。但由于使用盐浓度改变沉淀DNA会使DNA沉淀不完全，收率会较低。一般而言，CTAB法比较适用于草本植物和不含酚类或含酚类较少的植物DNA提取[16]，但在进行DNA提取时，应当确定植物材料和CTAB提取液的最佳比例，提高CTAB浓度不一定能提到高质量的DNA，加入CTAB过多或过少都会影响DNA的提取效果，可能不能彻底去除蛋白质，点样孔杂质较多[17，18]。三色堇叶片的酚类物质含量较高，在磨样过程中，叶片中的酚类物质会释放出来，易褐变[19]，在提取中加入β-巯基乙醇和PVP可以抑制叶片中酚类物质的氧化[20]。使用CTAB法提取DNA时，水浴时间至少需要30 min，过短的水浴时间会造成DNA得率的下降，而过长的水浴时间，如超过90 min，则可能会引起DNA的降解，或者最终产物中增加其他杂质，因此，适宜的水浴时间为45～60 min[21]。

本试验中改良CTAB法加入了STE缓冲液，使DNA中混入杂质的几率大大减低，所得的DNA纯度较高。且此法在沉淀DNA过程中不需要置于-20 ℃，在加入NaAc和无水乙醇后，絮状物的DNA沉淀清晰可见。改良CTAB法步骤简单，且能有效地去除多糖、酚类和蛋白质等物质，在短时间内获得纯度高、完整性好的DNA，节省了时间，整个提取过程大约3 h，比SDS法和CTAB法的时间都有较大缩短，极大地提高了提取效率，且能够进一步满足分子生物学的试验要求，是快速大量提取三色堇叶片DNA的理想方法。同时，该方法也对其他植物叶片DNA的提取提供了一定的借鉴。

在DNA提取过程中，影响提取效果的因素很多，如叶片研磨时间的长短，吸取上清液时是否吸出下层蛋白质以及混匀振荡程度高低等[22]。本试验中三色堇DNA提取结果在尽量使各种因素影响程度最小的情况下进行，因此想要获得高质量的DNA，除了注意选择提取方法外，还应进行严格的技术操作。endprint