孔玉龙 王克玉 张秀文 马伟元

羧甲基壳聚糖膜对人皮肤黑素细胞的生物相容性研究

孔玉龙 王克玉 张秀文 马伟元

目的探讨羧甲基壳聚糖膜对健康人黑素细胞的生物相容性，探索羧甲基壳聚糖膜搭载黑素细胞的可行性。方法使用流延法联合戊二醛交联法制备羧甲基壳聚糖膜，黑素细胞分离培养技术分离培养健康人黑素细胞，使用HMB45染色、MTT法、NaOH裂解法、酪氨酸酶活性检测等方法检测羧甲基壳聚糖膜对黑素细胞功能的影响。结果倒置显微镜下观察，黑素细胞在羧甲基壳聚糖膜上分布均匀，形态正常。免疫组化染色显示，贴附于羧甲基壳聚糖膜的黑素细胞抗HMB45单克隆抗体染色阳性。利用MTT法测定的黑素细胞增殖曲线显示，羧甲基壳聚糖可以支持黑素细胞的正常生长，黑素合成量（A值为0.083±0.015）与培养皿所培养的黑素细胞（A值0.066±0.008）比较，差异无统计学意义（t=2.38，P＞0.01）；黑素细胞酪氨酸酶活性（A值0.234±0.083）与培养皿培养的黑素细胞（A值0.241±0.061）比较，差异无统计学意义（t=0.23，P＞0.05）。结论羧甲基壳聚糖膜可以维持黑素细胞的正常功能，具有较好的生物相容性。

黑素细胞；壳聚糖；膜，人工；生物相容性材料

羧甲基壳聚糖（carboxymethyl chitosan，CM-chitosan）是壳聚糖的水溶性衍生物［1］，具有良好的组织相容性、可吸收性、无毒性、抗菌性及良好的成膜性等，在食物保鲜、制药、伤口处理等方面已有广泛应用［2］。白癜风是一种常见的后天性色素脱失性皮肤黏膜病，外科治疗如钻孔移植、负压吸疱法、自体表皮培养移植、自体培养黑素细胞悬液移植等已逐渐成为主要的治疗方法［3-4］。其中自体培养黑素细胞悬液移植可以较少的皮肤取材治疗较大面积的皮损，但因细胞悬液的流动性，往往导致黑素细胞不易在移植床部位定植而影响疗效。我们利用羧甲基壳聚糖膜搭载黑素细胞，研究羧甲基壳聚糖膜对黑素细胞的生物相容性。

材料与方法

一、材料

羧甲基壳聚糖为青岛弘海生物技术有限公司产品，M254黑素细胞培养基、HMGS添加剂、胎牛血清等为美国Gibco公司产品；噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、左旋多巴为美国Sigma公司产品；抗HMB45单克隆抗体为美国Zymed生物技术有限公司产品。

二、方法

1.膜的制备：将羧甲基壳聚糖溶于双蒸水中，配制成3%溶液，以500×g离心20 min，取上清液加入到培养板（6孔板、96孔板）中，60℃烘干，再将膜放入含0.5%戊二醛、3%冰醋酸、50%乙醇的混合溶液中交联12 h，1%磷酸盐缓冲液（PBS）反复冲洗3遍，每遍5 min，紫外线灯照射12 h，加入适量M254 浸泡 4 h 备用［5］。

2.黑素细胞的分离培养：取本院泌尿外科包皮环切术后的皮肤标本置于含有双抗的PBS中浸泡备用。在超净台中切除周围坏死的组织及皮下组织，将组织标本切成0.5 cm×0.5 cm的小块，在培养皿中加入0.25%胰酶，将组织小块的真皮面朝下浸于胰酶中，4℃消化过夜，吸去胰酶，PBS清洗2遍，将表皮与真皮分离，并将表皮用0.25%胰酶37℃消化30 min。加入10%血清终止消化，轻轻吹打成单个细胞。以200×g离心力5 min，弃上清，加入M254完全培养基10 ml，轻轻吹打成单细胞悬液，然后分装到两个25 cm培养瓶中。置于培养箱中培养，每3天换液1次，10 d后传代，取第3代细胞进行实验［6］。

3.细胞贴附情况观察：将黑素细胞制成1×105/ml的细胞悬液。分别滴加到羧甲基壳聚糖膜的6孔板和普通6孔板内，每孔中加2 ml，每3天换液1次，并在倒置相差显微镜下观察细胞贴附情况。

4.细胞爬片制作及抗HMB45染色：将羧甲基壳聚糖按照上述方法制作到爬片上，将细胞调整到1×106/ml，分别种植到羧甲基壳聚糖膜的爬片和普通爬片上，置于细胞培养箱中培养3 d，取出爬片，用4℃丙酮固定5 min，消除内源性过氧化物酶，并封闭非特异性抗原。分别加入鼠抗人HMB45单克隆抗体及生物素标记的第二抗体，然后加入现配的DAB试剂显色，最后经过冲洗、复染、脱水、透明、封片。

5.采用MTT法测定黑素细胞的生长曲线：取16个96孔板，平均分成两组，将羧甲基壳聚糖膜按上面的方法做到其中一组中，另一组培养板不做处理，在两组96孔板上接种黑素细胞，每板选择6个孔，细胞调整为 1 × 105/ml，接种后分别在 1、2、3、4、5、6、7、8 d时，分别取 1块实验板和普通板，测定各孔在490 nm波长下的吸光度（A），取平均值描绘出各自的生长曲线。

6.NaOH裂解法检测黑素含量：分别从羧甲基壳聚糖膜培养皿及普通培养皿中收集1×106个黑素细胞，分别加入0.2 ml双蒸水使细胞悬浮1 min，然后加入500 μl乙醚和500 μl乙醇的混合物室温下放置15 min，1 300×g离心5 min，弃上清，沉淀中加入 1 mol/L NaOH（含 10%DMSO）1.0 ml，于 80 ℃下30 min，加入4.0 ml双蒸水，分光光度计下测量475 nm处的A值，并进行统计学分析［7］。

7.酪氨酸酶活性测定：将黑素细胞以5×104/孔分别接种于普通96孔板和羧甲基壳聚糖膜覆盖的板，在37℃5%CO2下孵育。每隔2 d换1次培养基，孵育7 d后用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗1次，然后每孔加入1%TritonX-100溶液100 μl，超声振荡30 min后，每孔加入100 μl 0.1%左旋多巴溶液，于37℃下3 h，在酶标仪475 nm波长下测量各孔A值，并进行统计学分析［7-8］。

结 果

一、黑素细胞贴附情况

接种在羧甲基壳聚糖膜上的黑素细胞分布均匀，培养7 d后，细胞生长良好，树突数量有所增加，伸展良好充分，细胞形态与普通培养皿上黑素细胞形态相似（图 1、2）。

二、HMB45染色后的情况

接种于羧甲基壳聚糖膜上的黑素细胞HMB45染色阳性（图 3、4）。

三、生长曲线比较

生长曲线显示，黑素细胞可以在羧甲基壳聚糖膜上增殖，增殖趋势与普通培养皿相近（图5），总体趋势略低于普通培养皿。

四、黑素含量、酪氨酸酶活性比较

羧甲基壳聚糖膜组黑素细胞内黑素含量（A值）为0.083±0.015，普通培养皿组为0.066±0.008，两组比较，t=2.38，v =38，P ＞ 0.01， 差异无统计学意义。酪氨酸酶活性测定，羧甲基壳聚糖膜组为0.234±0.083，普通培养皿组为0.241±0.061，两组比较，t=0.23，v=38，P ＞ 0.05，差异无统计学意义，表明羧甲基壳聚糖膜上的黑素细胞可以正常合成黑素。膜性、水溶性差等。

图1 普通培养皿中培养7 d后的黑素细胞

图2 羧甲基壳聚糖膜培养皿中培养7 d后黑素细胞

图3 普通爬片上黑素细胞经HMB45染色

图4 羧甲基壳聚糖膜覆盖的爬片上黑素细胞经HMB45染色阳性表现

图5 噻唑蓝法测定黑素细胞的生长曲线黑素细胞可以在羧甲基壳聚糖膜上增殖，总体趋势略低于普通培养皿

讨 论

在本实验研究中，我们选用了羧甲基壳聚糖作为黑素细胞的载体。将羧甲基壳聚糖直接加入培养板中，操作简单，便于消毒，易于细胞培养，并且羧甲基壳聚糖膜可以取出，质地柔软，可以紧密贴附在皮肤表面。研究结果显示，黑素细胞可以很好的贴附于羧甲基壳聚糖膜表面，在膜上分布均匀，树枝状突起伸展充分，黑素细胞能很好地在膜上生长、增殖。同时实验证实，羧甲基壳聚糖膜能够维持黑素细胞的正常酪氨酸酶活性及黑素合成的功能。表明羧甲基壳聚糖膜与黑素细胞具有良好的生物相容性，将来可作为一种新的搭载黑素细胞的材料，在大面积色素脱失性疾病治疗方面具有良好的临床应用前景。

近年来，自体培养黑素细胞移植逐渐成为治疗稳定期白癜风的重要方法，尤其是大面积患者。该方法主要是将培养的自体黑素细胞制备成细胞悬液，通过各种方法直接移植到色素脱失部位［9］。为了提高疗效，有学者将透明质酸添加到细胞悬液中，不仅增加了悬液的黏度，同时透明质酸还可以促进黑素细胞的生长和增殖［10］。随着组织工程技术的发展延伸，有学者利用聚乳酸、羊膜、硅胶、壳聚糖等［11］材料构建搭载转移黑素细胞的载体，然后将细胞转移到移植部位，取得一定进展。但这些材料亦有其不足之处，如羊膜具有潜在的生物安全危害，壳聚糖成

[1]Huang X,Zhang Y,Zhang X,et al.Influence of radiation crosslinked carboxymethyl-chitosan/gelatin hydrogelon cutaneouswound healing[J].Mater Sci Eng C Mater Biol Appl,2013,33（8）；4816-4824.

[2]吴迪,邹清河,刘辉,等.羧甲基壳聚糖体外抗氧化作用[J].中国医院药学杂志,2013,33（19）；1573-1576.

[3]Trupar E,Brychta P.Perspectives of surgical treatment of vitiligo[J].Cas Lek Cesk,2009,148（3）；129-131.

[4]Sharquie KE,Noaimi AA,Al-Mudaris HA.Melanocytes transplantation in patientswith vitiligo using needling micrografting technique[J].J Drugs Dermatol,2013,12（5）；e74-e78.

[5]郑立,陈西广,刘万顺,等.羧甲基壳聚糖膜对皮肤成纤维细胞相容性研究[J].生物化学与生物物理进展,2003,30（2）；314-320.

[6]Huang Q,Liang W,Xu D,et al.Ultrastructural observations of human epidermal melanocytes cultured on polyethylene terephthalate film[J].Micron,2013,48；49-53.

[7]Chan YY,Kim KH,Cheah SH.Inhibitory effects of Sargassum polycystum on tyrosinase activity and melanin formation in B16F10 murine melanoma cells[J].J Ethnopharmacol,2011,137（3）；1183-1188.

[8]Hu DN.Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cellsin vitro[J].Photochem Photobiol,2008,84（3）；645-649.

[9]洪为松,傅丽芳,尉晓冬,等.自体黑素细胞移植治疗白癜风细胞接种量与疗效关系的研究[J].中华皮肤科杂志,2013,46（4）；235-238.

[10]卢涛,金岩,聂鑫,等.黑素细胞悬液中加入透明质酸的最佳浓度选择[J].中国美容医学,2004,13（1）；25-27.

[11]许思原,王文俊,董东,等.用于黑素细胞培养和移植的壳聚糖/明胶复合交联膜的制备与表征[J].材料科学与工程学报,2012,30（2）；208-213.

2014-02-14）

（本文编辑：颜艳）

Biocompatibility of carboxymethyl chitosan membranes with human skin melanocytes

Kong Yulong,Wang Keyu,Zhang Xiuwen,Ma Weiyuan.Department of Dermatology,Qilu Hospital of Shandong University,Jinan 250012,China

；Wang Keyu,Email；wangkeyu@medmail.com.cn

ObjectiveTo study the biocompatibility of carboxymethyl chitosan （CMCS） membrane with melanocytes from healthy human skin,and to investigate the feasibility to transport and carry melanocytes by using CMCS membrane.MethodsCMCS membrane was prepared by a casting method combined with a glutaraldehydebased cross-linking method.Melanocytes were isolated from the foreskin of healthy men,and subjected to primary culture and subculture.The third-passage melanocytes were classified into two groups to be cultured on the CMCS membrane（test group） or traditional culture plates（control group）.Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT） assay was performed to evaluate the proliferative activity of melanocytes,and a sodium hydroxide-based lysis method to determine melanin content.HMB45 staining was conducted,and tyrosinase activity was estimated for melanocytes.ResultsInverted microscopy showed that melanocytes were evenly distributed on the CMCS membrane with a normal shape.The melanocytes adherent to the CMCS membrane stained positive for anti-HMB45 monoclonal antibody.The growth curve of the melanocytes on the CMCS membrane,which was obtained from MTT assay,demonstrated that CMCS membrane could support the normal growth of melanocytes.No significant difference was observed between the test group and control group in melanin content（0.083±0.015 vs.0.066±0.008,t=2.38,P＞0.01）or tyrosinase activity（0.234±0.083 vs.0.241±0.061,t=0.23,P＞0.05）.ConclusionCMCS membrane can maintain the normal biological activity of melanocytes and have good biocompatibility with skin melanocytes.

Melanocytes；Chitosan；Membranes,artificial；Biocompatible materials

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.011.007

山东省自然科学基金（Y2008C78）

250012济南，山东大学齐鲁医院皮肤科

王克玉，Email：wangkeyu@medmail.com.cn