吴艳华 汤楠 蔡兰花 李其林

阿魏酸对黑素细胞增殖、黑素合成、酪氨酸酶活性及c-kit、ERK蛋白表达的影响

吴艳华 汤楠 蔡兰花 李其林

目的探讨阿魏酸对体外培养的正常人表皮黑素细胞增殖、黑素合成、酪氨酸酶活性及c-kit、ERK蛋白表达的影响。方法以不同浓度的阿魏酸干预体外培养的正常人表皮黑素细胞,用MTS法分别检测培养24、48、72 h后黑素细胞的增殖活性。用NaOH裂解法检测培养72 h后黑素细胞的黑素合成。用多巴氧化反应法测定培养72 h后黑素细胞酪氨酸酶活性。用Western印迹法测定培养72 h黑素细胞c-kit蛋白及ERK1/2蛋白表达水平。结果与对照组相比,0.01、0.1、1 mg/ml阿魏酸在作用24、48、72 h后,抑制黑素细胞增殖作用的差异有统计学意义(均P＜0.05),其中1 mg/ml阿魏酸作用72 h抑制黑素细胞活性最高。0.01、0.1、1 mg/ml阿魏酸均能显著影响黑素合成和酪氨酸酶活性,并可降低黑素细胞中c-kit蛋白及ERK1/2蛋白表达水平,与对照组相比,差异有统计学意义(均P＜0.05)。结论阿魏酸可抑制培养的人表皮黑素细胞增殖、黑素合成及酪氨酸酶活性,并可下调黑素细胞c-kit蛋白及ERK蛋白的表达。

阿魏酸;黑素细胞;细胞增殖;酪氨酸;原癌基因蛋白质c-kit

黄褐斑主要病因可能与紫外线、内分泌、遗传、氧自由基、药物与化妆品、口服避孕药、局部微生态、机体系统性病变、情绪波动等因素有关[1]。其发病机制有多种学说:①黄褐斑患者皮损区黑素细胞的合成功能活跃,基底层黑素颗粒增加,但黑素细胞却没有增殖[2];②黄褐斑皮损区表皮不仅黑素细胞数目增多,同时伴有基底层黑素细胞和黑素颗粒增加[3]。阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基苯丙烯酸)是当归、川芎、升麻等中药的有效成分之一,国内学者在当归对黄褐斑的治疗方面进行了初步研究,得到了较为积极的结果[4]。已有研究表明,阿魏酸有抗氧化的作用,可用于皮肤病治疗,如黄褐斑等[5]。但阿魏酸治疗黄褐斑的具体作用机制尚未明确,我们旨在研究当归单体阿魏酸对人表皮黑素细胞增殖、黑素合成、酪氨酸酶活性及c-kit蛋白、ERK蛋白表达的影响,探讨阿魏酸治疗黄褐斑的可能机制。

材料与方法

一、试剂与材料

黑素细胞株购于美国Lonza公司,为正常成人表皮黑素细胞,货号CC-2586(NHEM-Ad),生产批号21793-0127。阿魏酸购于中国食品药品检定研究所,以MBM完全培养基配制成100 mg/ml的溶液,置于-20℃的冰箱中保存。临用前以新鲜MBM完全培养基调配至实验所需浓度,根据预实验结果,设定阿魏酸实验终浓度为0.01、0.1、1 mg/ml。

主要试剂:黑素细胞基础培养基MBMTM-4(货号CC-3250)、黑素细胞生长添加剂MGMTM-4(货号CC-4435)、类皮素-3 Endothelin-3(货号CC-4510)、左旋多巴(L-Dopa)、Trypain/EDTA Solution(美国Lonza公司)。MTS、4%甲醛(武汉博士德生物工程有限公司),中性树胶(上海恒远生物科技有限公司), SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(碧云天生物技术研究所),蛋白Marker(美国Thermo公司),Tris(广州生物科技有限公司),羊抗兔IgG(美国Earthoc公司)。c-kit Rabbit mAb、ERK1/2 Rabbit mAb(美国Cell Signaling公司)。

二、方法

1.黑素细胞的培养及鉴定:完全黑素细胞培养基:MBMTM-4、MGMTM-4、Endothelin-3混匀液,置入100 ml的分装瓶中,放入-4℃的冰箱中保存。正常成人表皮黑素细胞株接种于细胞培养瓶中,生长融合达70%～80%时可进行传代培养,1∶2传代,每瓶加入约3～4 ml的完全培养基,移入37℃含CO2浓度为5%的恒温培养箱中培养。

L-Dopa染色法鉴定黑素细胞,取处于对数生长期的正常人表皮黑素细胞,调整细胞浓度为2.5× 104/ml,接种于已添加相应盖玻片的6孔细胞培养板中培养,4%甲醛固定细胞20～25 min,L-Dopa染色液40 min,每隔30 min观察黑素细胞的染色情况,更换染液,约3 h后染液呈棕色,终止染色漂洗盖玻片2 min,苏木素复染细胞核,梯度酒精逐级脱水,中性树胶封片,常温下晾干,激光共聚焦显微镜下观察黑素细胞的鉴定情况,拍照。

2.MTS法测定黑素细胞增殖:以5×104/ml接种于96孔细胞培养板中,培养24 h,分别加入不同浓度阿魏酸,设对照组(仅黑素细胞和完全培养基)。每个浓度设5个复孔,分别培养24、48、72 h,观察黑素细胞形态变化,加入MTS显色液,每孔20 μl,37℃培养4 h终止培养,490 nm波长下检测各孔吸光度A值。

3.NaOH裂解法测定黑素细胞的黑素合成:预先用不同浓度阿魏酸溶液培养细胞72 h。每孔加入100 μl浓度为1 mmol/L的NaOH溶液裂解细胞, 37℃水浴箱中水浴1 h,酶标仪在450 nm波长下测量各孔吸光度A值。

4.Dopa氧化反应法测定黑素细胞酪氨酸酶活性:预先用不同浓度阿魏酸溶液培养细胞72 h。每孔加入90 μl浓度为1%的TritonX-100溶液,置入-80℃冰箱中冻存30 min,室温使细胞完全裂解,每孔加入10 μl浓度为0.1%的L-Dopa溶液,恒温37℃,含CO2浓度为5%培养箱中孵育2 h,酶标仪在490 nm波长下测量各孔吸光度A值。

5.Western印迹法测定黑素细胞c-kit蛋白及ERK1/2蛋白表达水平:预先用不同浓度阿魏酸溶液培养细胞72 h。根据RIPA裂解液(强)试剂盒说明书提取黑素细胞蛋白,-80℃低温冰箱中保存;配好分离胶及浓缩胶,加入蛋白样品。电泳:浓缩胶用80 V时间30～40 min、分离胶100 V时间60～70 min,终止电泳后转膜;封闭及杂交:结合一抗、二抗。化学发光及凝胶图象分析:采用Super ECL发光液,采用凝胶图象处理分析系统(Image Lab)进行条带分析,分析每条条带的灰度值,同时计算每组目的条带蛋白灰度值与内参条带蛋白灰度比值。

6.统计学方法:用统计学软件SPSS17.0进行统计学分析,计量资料用±s表示,两个因素的组间比较采用两个因素多个水平的析因设计与方差分析,单个因素的组间比较采用单因素方差分析(one way-ANOVA),方差齐时采用 SNK(Student-Newman-Keuls)法进行组间两两比较;各组方差不齐,则采用Tamhane T2检验方法,P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、正常人表皮黑素细胞的培养及鉴定

正常人表皮黑素细胞传代培养经12～24 h后即可贴壁,倒置显微镜下可见呈梭形的树突状细胞,树突形状细长。细胞传代培养24 h后首次换液。后期每隔2～3天换一次液,倒置显微镜下可见黑素细胞逐渐增殖,树突数量逐渐增多至2个以上,最多者可达6～7个树突。约10～15 d后,黑素细胞接近融合状态(70%～80%),细胞树突间交织成网状,则可进行传代,可见大量的黑素细胞(图1)。经左旋多巴(L-Dopa)染色后的正常人表皮黑素细胞,呈阳性反应,黑素细胞各细胞树突及胞质呈黑色或棕褐色(图2)。

图1 培养的正常黑素细胞(×200)

图2 左旋多巴染色鉴定的黑素细胞(×200)

二、阿魏酸对黑素细胞增殖活性的影响

与对照组相比,0.01、

0.1、1 mg/ml阿魏酸在作用24、48、72 h后,抑制黑素细胞增殖作用的差异有统计学意义(均P＜0.05),其中1 mg/ml阿魏酸作用72 h抑制黑素细胞增殖活性最高。见表1。

表1 阿魏酸对黑素细胞增殖的影响(A值,±s)

表1 阿魏酸对黑素细胞增殖的影响(A值,±s)

注:与对照组比较,a:P＜0.05

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三、阿魏酸对黑素细胞黑素合成的影响

各组数据经方差分析结果显示:不同浓度阿魏酸溶液对黑素细胞黑素合成的影响不同(F= 36.924,P=0.000),差异有统计学意义;即随着阿魏酸浓度的增大黑素合成逐渐减少,0.01 mg/ml组、0.1 mg/ml组、1 mg/ml组较对照组,对黑素合成均有统计学意义,1 mg/ml组较0.01 mg/ml组对黑素合成抑制较明显,差异有统计学意义,但0.1 mg/ml组与0.01 mg/ml组、1 mg/ml组比较,对黑素合成的影响差异无统计学意义。见表2。

表2 阿魏酸对黑素合成的影响(±s)

表2 阿魏酸对黑素合成的影响(±s)

注:与对照组相比,a:P＜0.05;与0.01 mg/ml组相比,b:P＜0.05

组别 复孔对照组 5 0.01 mg/ml组 5 0.1 mg/ml组 5 1 mg/ml组 5 A值0.039±0.006 0.028±0.002a 0.025±0.001a 0.021±0.001ab

四、阿魏酸对酪氨酸酶活性的影响

各组数据经方差分析结果显示:不同浓度阿魏酸溶液对黑素细胞酪氨酸酶活性的影响不同(F= 333.017,P=0.000),方差分析差异有统计学意义,即随着阿魏酸浓度的增大酪氨酸酶活性逐渐减弱, 0.01 mg/ml组、0.1 mg/ml组、1 mg/ml组较对照组,对酪氨酸酶活性影响差异均有统计学意义,1 mg/ml组较0.01 mg/ml组、0.1 mg/ml组对酪氨酸酶活性,差异均有统计学意义。见表3。

表3 阿魏酸对黑素细胞酪氨酸酶活性的影响(±s)

表3 阿魏酸对黑素细胞酪氨酸酶活性的影响(±s)

注:与对照组相比,a:P＜0.05;与0.01 mg/ml组相比,b:P＜0.05;与0.1 mg/ml组相比,c:P＜0.05

A值0.162±0.006 0.144±0.003a 0.121±0.002ab 0.095±0.005abc组别 复孔对照组 5 0.01 mg/ml组 5 0.1 mg/ml组 5 1 mg/ml组 5

五、阿魏酸对黑素细胞c-kit及ERK1/2蛋白表达水平的影响

与对照组比较,0.01、0.1、1 mg/ml c-kit蛋白表达及ERK1/2均有明显降低(P＜0.05);以1 mg/ml组下降最显著。见表4,图3,4。

表4 阿魏酸对黑素细胞c-kit及ERK1/2蛋白表达水平的影响(±s)

表4 阿魏酸对黑素细胞c-kit及ERK1/2蛋白表达水平的影响(±s)

注:与对照组比较,a:P＜0.05;与0.01mg/ml组比较,b:P＜0.05;与0.1 mg/ml组相比,c:P＜0.05

c-kit ERK1/2 0.46±0.06 1.89±0.12 0.37±0.03a 0.85±0.07a 0.34±0.02ab 0.76±0.08ab 0.18±0.03ab 0.63±0.18abc组别 复孔对照组 5 0.01mg/ml组 5 0.1mg/ml组 5 1mg/ml组 5

图3 阿魏酸对黑素细胞c-kit蛋白表达水平的影响

图4 阿魏酸对黑素细胞ERK1/2蛋白表达水平的影响

讨论

阿魏酸主要有抗氧化[5]、清除氧自由基、有效抑制血小板聚集和血栓形成等方面的药理活性[6]。Di Domenico等[7]研究表明,阿魏酸的抗氧化作用可保护色素增多性皮肤病引起的氧化应激反应,同时对活性氧的产生、蛋白质氧化和脂质过氧化也有保护作用。张延萍等[8]认为,阿魏酸不仅能降低酪氨酸酶的单酚酶活力,还能明显地延长酪氨酸酶反应的迟滞时间,是一种强效的酪氨酸酶抑制剂。本实验结果表明:与对照组比较,不同浓度组的阿魏酸溶液对黑素细胞增殖、黑素细胞黑素合成、酪氨酸酶活性均有明显的抑制作用(P＜0.05),结果提示,阿魏酸可抑制酪氨酸酶活性,抑制黑素合成,这可能是阿魏酸治疗黄褐斑有效机制之一。

黑素细胞表面具有c-kit受体,c-kit受体即为酪氨酸酶受体。Alexeev等[9]认为,c-kit受体在黑素细胞生理学中起关键作用,主要影响黑素生成、增殖、迁移和存活的色素生成细胞。Luo等[10]通过对野生型小鼠和白斑突变型小鼠的配体和受体分子进行研究发现,c-kit受体主要是通过酪氨酸激酶信号通路的改变与皮肤、毛囊的色素障碍性疾病有关,表明了c-kit对黑素细胞的功能起作用。Moss等[11]研究显示:小鼠和人类的毛发的色素脱失与c-kit的表达密切相关,越是色素缺失的皮损处,c-kit受体的表达越是减少。由此可见,c-kit受体的酪氨酸激酶信号通路在黑素细胞的黑素合成和黑素细胞的存活、迁移中起着重要作用,c-kit表达的减少导致黑素细胞的损伤。Goodall等[12]认为,可能通过抑制PDGF2β和IL21β等基因表达,抑制ERKl/2活性,后者可能进一步影响原癌基因的表达,而原癌基因表达的减少将直接导致与细胞增殖有关的蛋白质基因的转录和表达减少,从而抑制细胞增殖;同时通过激活MEK/ERK的信号通路导致磷酸化MITF在丝氨酸73表达,MITF是众所周知的通过控制色素沉着的一种黑素生成调节酶,导致其降解。Yao等[13]研究认为:通过抑制黑素的合成能力,激活ERK途径,从而抑制酪氨酸酶的活性,减少黑素合成。本研究结果显示:不同浓度的阿魏酸溶液对黑素细胞的c-kit蛋白及ERK1/2蛋白表达水平均有下调作用。由此可见,抑制ERK1/2活性,则可抑制酪氨酸酶活性,使黑素合成减少,从而达到治疗黄褐斑等色素增多性疾病的目地。

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2014-07-04)

(本文编辑:吴晓初)

Effect of ferulic acid on the proliferation of,as well as melanin synthesis,tyrosinase activity and expressions of c-kit and ERK proteins in keratinocytes

Wu Yanhua*，Tang Nan，Cai Lanhua，Li Qilin.*Fourth Affiliated Hospital of Jinan University School of Medicine;Department of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou Red Cross Hospital，Guangzhou 510220，China

Wu Yanhua，Email:wuyanhua368@163.com

ObjectiveTo evaluate thein vitroeffect of ferulic acid on the proliferation of，as well as melanin synthesis，tyrosinase activity and expressions of c-kit and ERK proteins in cultured normal human epidermal melanocytes.MethodsCultured normal human epidermal melanocytes were treated with various concentrations of ferulic acid for different durations，and those remaining untreated served as the control.Then，3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，inner salt(MTS)assay was performed to estimate cell proliferative activity at 24，48 and 72 hours，sodium hydroxide solubilization method to quantify melanin content in melanocytes at 72 hours，dopa oxidation assay to evaluate tyrosinase activity at 72 hours，Western blot to measure the expressions of c-kit and ERK1/2 proteins at 72 hours.ResultsCellular proliferative activity was significantly inhibited in melanocytes treated with ferulic acid of 0.01，0.1 and 1 mg/ml for 24，48 and 72 hours compared with untreated melanocytes(allP＜0.05)，and the 72-hour treatment with ferulic acid of 1 mg/ml showed the strongest inhibitory effect.Ferulic acid at 0.01，0.1 and 1 mg/ml all markedly suppressed melanin synthesis and tyrosinase activity，decreased the expressions of c-kit and ERK1/2 proteins in melanocytes，with significant differences in these parameters between ferulic acid-treated and untreated melanocytes(allP＜0.05).ConclusionsFerulic acid could downregulate the proliferation of，as well as melanin synthesis，tyrosinase activity，and expressions of c-kit and ERK proteins in cultured human epidermal melanocytes.

Ferulic acid;Melanocytes;Cell proliferation;Tyrosine;Proto-oncogene proteins c-kit

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.10.014

广东省科技计划项目(2011B031800034)

510220广州,暨南大学医学院第四附属医院、广州市红十字会医院中医科(吴艳华、汤楠、蔡兰花),皮肤科(李其林)

吴艳华,Email:wuyanhua368@163.com