贾 欣，韩淑萍，孙惠斌，王宇辉，张超锋，杜 斌

1)郑州大学药学院 郑州450001 2)郑州市第二人民医院药剂科 郑州450006

2－甲氧基雌二醇(2－ME)是一种新型甾体激素类抗肿瘤药物，目前在国外处于Ⅱ期临床研究阶段［1－2］。体内外药效学研究［3－5］表明，2－ME 对多种肿瘤细胞均有良好的抗肿瘤作用，且具有高效低毒、不易产生耐药性等特点。然而2－ME 水溶性差，口服吸收无规律，明显的首过效应［6］限制了其应用。针对这些缺点设计了供静脉注射用的2－ME 纳米混悬剂［7］。该研究中作者建立了Lewis 肺癌荷瘤小鼠模型，进一步研究2－ME 纳米混悬剂在肺癌荷瘤鼠体内组织的分布，以期为该剂型的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 材料 药品与试剂:2－ME(纯度99%，自制)，环孢素A(纯度98．5%，批号120308，武汉鑫佳灵生物科技有限公司)，胎牛血清(批号1010511，美国TCB 公司)，甲醇(色谱纯，德国Merck 公司)，乙腈(分析纯，天津市协和昊鹏色谱科技有限公司)，其他试剂均为分析纯。实验动物:SPF 级昆明种小鼠雌雄各半，(20 ±2)g，由山东鲁抗医药股份有限公司提供，动物质量合格证号SCXK(鲁)20080002。瘤株:鼠源性肺腺癌细胞株Lewis 购自上海生命科学研究院细胞资源中心。仪器:Agilent 1200 高效液相色谱仪(美国Agilent 公司)，T25 数显匀浆机(德国IKA 实验技术公司)，MD200－2 型氮气吹扫仪(杭州奥盛仪器有限公司)，Z36HK 大容量高速冷冻离心机(德国贝托特·哈默机械制造股份公司)。

1．2 试液的配制

1．2．1 2－ME 贮备液及标准溶液的制备 精密称取2－ME 64．00 mg，置于25 mL 量瓶中，甲醇溶解稀释至刻度，配制成2．56 g/L 的2－ME 贮备液。以上述贮备液配制成质量浓度范围在0．25～256．00 mg/L的标准溶液。

1．2．2 2－ME 溶液的配制 精密称取2－ME 40．00 mg 溶于2 mL 无水乙醇中，加超纯水7 mL、聚氧乙烯氢化蓖麻油1 mL，50℃热熔搅拌0．5 h，制成质量浓度为4．00 g/L 的2－ME 溶液［8］，灭菌。

1．2．3 2－ME 纳米混悬剂的制备 精密称取2－ME 32．00 mg 和卵磷脂192．00 mg，加入无水乙醇4 mL，超声使溶解，构成有机相;称取192．00 mg 泊洛沙姆188、3．20 mg 十二烷基硫酸钠及19．20 mg 羧甲基纤维素钠，溶于8 mL PBS 中，构成水相。3 000 g 磁力搅拌下将有机相缓慢滴入水相，继续搅拌30 min，充分乳化，然后常温减压旋蒸除去有机溶剂，探超30次，每次3 s，制得4．00 g/L 乳白色纳米混悬剂。

1．3 实验动物分组与处理 参照文献［9］建立Lewis 肺癌荷瘤鼠模型并将荷瘤鼠采用随机数字表法分为2组，即2－ME 纳米混悬剂组(实验组)和2－ME溶液组(对照组)，每组35只。给药前禁食12 h，自由饮水。实验组小鼠尾静脉注射40 mg/kg 的2－ME 纳米混悬剂，对照组同法给予2－ME 溶液。给药5、15、30、60、120、240、480 min 后分别取5只小鼠，摘眼球取血，脱颈椎处死后，立即分离心、肝、脾、肺、肾、胃、脑及瘤组织样品，－20℃冰箱保存。精密称取各组织样品，加入生理盐水(样品质量与生理盐水体积比，肝、肾、胃、脑、瘤按1∶2，脾、心按1∶3，肺按1∶4)，用组织匀浆机研磨处理，制成组织匀浆液。取组织匀浆液(肾、肺、肝、脑、脾及瘤组织取500 μL，血浆、心及胃组织取250 μL)于5 mL玻璃离心管中，加入6 倍体积的乙酸乙酯－乙腈－异丙醇(体积比为3∶2∶1)，涡流混合3 min，超声10 min，4 000 g 离心15 min，取上清液，40℃下氮气流吹干，残留物加100 μL 流动相复溶，涡流振荡1 min，15 000 g 离心15 min，取上清液20 μL 进样。

1．4 色谱条件 Diamosil－C18(200 mm×4．6 mm，5 μm)为分析柱;流动相为甲醇∶水(体积比为65∶35);流速1 mL/min;柱温30℃;激发波长285 nm，发射波长325 nm;20 μL 进样。

1．5 方法学验证 标准曲线和定量限:精密量取不同质量浓度的2－ME 标准溶液，40℃氮气吹去溶媒，分别加入空白血浆及组织的空白匀浆样品，涡旋1 min 混匀，配制成不同质量浓度的标准溶液(n =3)，以峰面积A 对样品中药物浓度C 进行回归，得回归方程，取S/N≥10 时样品浓度作为最低定量限。

日内精密度、日间精密度、提取回收率及方法回收率:取空白血浆和组织匀浆液，加入2－ME 溶液，配制成低、中、高3个浓度的质控样品，按1．3 处理生物样品，分别于日内测定5次计算日内精密度;连续测定5 d 计算日间精密度，并计算方法回收率及提取回收率。

1．6 数据处理和靶向性评价 采用Kinetica 4．4．1药动学软件(赛默飞世尔科技公司开发)对每个时间点血浆及各组织2－ME 的平均浓度进行分析，得AUC0－t。给药系统的靶向性评价采用相对摄取率(re)及总靶向效率(TEC)为评价参数，TEC =AUCi/∑AUC ×100%，AUCi 表示i组织的药时曲线下面积，TEC 越大，对该组织的靶向性越显著。re =(AUCi)实验组/(AUCi)对照组×100%，表示在某一组织或样本2种不同制剂的药物分布情况。

2 结果

2．1 方法学考察结果

2．1．1 色谱行为 血浆及各组织中内源性物质对样品测定无干扰，样品的保留时间为(10．28 ±0．73)min，分离度较好(图1)，理论塔板数均大于4 000。

2．1．2 线性范围 结果见表1。

2．1．3 精密度与回收率 结果见表2。

2．2 组织分布结果 不同时间点2－ME 纳米混悬液和2－ME 溶液在血浆和组织中的分布情况见表3。由表3 可知，对照组(2－ME 溶液组)中药物主要分布在血液以及血流丰富的组织中，血浆中分布最多，其次为肺、肝、肾;而实验组(2－ME 纳米混悬剂组)药物在血浆中的分布明显减少，在肺、瘤及肝组织中的分布明显增加，说明2－ME 纳米混悬剂具有明显的被动靶向性。

图1 血浆和组织色谱图

表1 2-ME 在各生物样品中的标准曲线

2．3 靶向性评价 2－ME 纳米混悬剂和2－ME 溶液的TEC 和re 结果见表4。由表4 可知，2－ME 纳米混悬剂在肺、瘤组织中的总靶向效率明显提高，肝组织中的靶向效率略有提高，在其他组织中的靶向分布均有所减低，其中在血浆中的分布减低尤为显著。心、肝、脾、肺、脑、瘤组织的re 均大于1，瘤组织的re最大。

表2 2-ME 在各生物样品中的精密度及回收率(n=5)

表3 不同时间点2-ME 纳米混悬剂和2-ME 溶液在血浆和组织中的分布情况(n=5) μg/g

表4 2-ME 纳米混悬剂和2-ME溶液在血浆和组织中的TEC 和re

3 讨论

研究［10］表明，2－ME 与血浆蛋白的结合率较高。在2－ME 溶液中，药物成游离的分子状态，使得药物可迅速与血浆蛋白结合，结合型药物不能透过毛细血管向组织器官转运，药物大量滞留于血液中。而2－ME 纳米混悬剂呈亚微米胶态分散体系，在血浆中常会被巨噬细胞作为外来物而吞噬，巨噬细胞主要分布于肺、疏松结缔组织、肝、脾等处［11］，因而降低了药物在血液中的浓度，更多地到达靶部位。有关2－ME 与肺细胞膜亲和性的研究［12］结果表明，肺泡表面存在与2－ME 特异性结合的受体，使得2－ME 纳米混悬剂具有较好的肺靶向性。肿瘤组织生长快速，血管形成较快，导致血管外膜细胞缺乏、基底膜变形，通透性增加，纳米粒有更多的机会蓄积在瘤体部位［13］，因此具有较好的肿瘤靶向性。该研究结果显示，2－ME 纳米混悬剂在血浆中的分布明显减少，在肺、瘤及肝组织中分布明显增加，说明2－ME 纳米混悬剂具有明显的被动靶向性。此外，靶向性评价结果显示，心、肝、脾、肺、脑、瘤组织的re 均大于1，瘤组织的re 最大，说明2－ME 纳米混悬剂对心、肝、脾、肺、脑、瘤均具有靶向性，且对瘤组织的靶向性最好。

总之，2－ME 纳米混悬剂具有良好的肺肿瘤靶向性，使用2－ME 纳米混悬剂有望增强药物的治疗效果，提高治疗指数;该研究为肺肿瘤的靶向治疗提供了一定的实验依据。

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