龙小琴 陆道敏 马武开 (贵阳中医学院研究生院，贵州 贵阳 550002)

苗药金乌健骨方由金毛狗脊、乌梢蛇、千年健、黑骨藤、青风藤、姜黄、白芍、三七粉等药物组成，具有温肾助阳、散寒通络、活血止痛之功效。前期的临床研究显示苗药金乌健骨方能够改善类风湿关节炎(RA)患者的临床症状和体征〔1〕，尤其在降低抗风湿药如甲氨蝶呤等的毒副作用方面显示了较好疗效〔2〕。本实验观察金乌健骨方对胶原诱导关节炎(CIA)大鼠血清炎症因子白介素-1(IL-1)、白介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响，研究金乌健骨方治疗RA的机制。

1 材料与方法

1.1 动物 成年健康雌性Wistar大鼠60只，体重(173±20)g，由重庆滕鑫生物技术有限公司提供，合格证号:SCXK(渝)2009001。各组大鼠在相同条件下自由饮食、摄水。饲料来源于贵阳医学院实验动物中心。

1.2 主要试剂、仪器 牛二型胶原、完全弗氏佐剂(美国 Sigma公司);醋酸(无锡飞鹏精细化工有限公司);IL-1、IL-1β及TNF-α酶免免试剂盒(北京惠康生物科技有限公司);低温冷冻离心机(德国eppendorf);冰箱(日本三洋);酶标仪(BioTek品牌，型号:Synergy 2 TM);电子秤(上海酬勤实业有限公司);大鼠足趾容积测量仪(淮北正华生物仪器设备有限公司)。

1.3 实验药物 ①金乌健骨方:金毛狗脊15 g，乌梢蛇10 g，千年健 15 g，黑骨藤9 g，青风藤30 g，姜黄20 g，白芍30 g，三七粉3 g(生药购自贵阳中医学院第二附属医院)等8味中药组成。金乌健骨方浓缩液按处方比例提取，浓缩至1.5 g/ml，4℃冰箱保存供实验用。②雷公藤多苷:湖南协力药业有限公司生产，临用时充分研磨后用蒸馏水配成混悬液，浓度为 1.2 mg/ml。

1.4 动物分组 60只SD雌性大鼠，适应性喂养3 d后，随机分为空白组，模型组，雷公藤多苷组及金乌健骨方低、中、高剂量组共6组，每组10只。

1.5 造模 实验前1 d用牛Ⅱ型胶原溶于0.1 mol/L醋酸中，4℃冰箱过夜，按2 mg/ml比例与弗氏不完全佐剂1∶1充分混合乳化。取适量牛Ⅱ型胶原溶液(浓度2 mg/ml)逐滴加入至等容积的不完全弗氏佐剂中，终浓度为1 mg/ml。冰浴中充分乳化，以滴入水中不扩散为度，取乳化后的混合物按0.3 ml注射。7 d后按 0.2 ml/只，于尾根部皮下加强免疫 1次〔3〕。

1.6 给药 从第2次免疫后第1天开始给药，空白组和模型组大鼠给予蒸馏水灌胃，2 ml/次，1次/d;雷公藤多苷组给予雷公藤多苷水溶液，剂量为6 mg/kg，2 ml/次，1次/d;金乌健骨方低、中、高剂量组分别给予不同质量浓度的金乌健骨方浓缩液(3 570、7 500、15 000 mg/kg)，2 ml/次，1 次/d，各组均连续灌胃28 d。

1.7 观察指标 ①一般行为表现:动物神态、毛色、活动情况、饮食及饮水量、大小便。②体重:分别于造模前1 d用电子天平称量各组动物体重以后每周称量1次。③关节肿胀程度:分别于造模前1 d用大鼠足趾容积测量仪测量各组大鼠左后足踝关节容积。肿胀率=造模后足踝关节容积-造模前足踝关节容积/造模前足踝关节容积×100%。末次灌胃24 h以后，予乌拉坦按大鼠体重以0.4 ml/100 g予腹腔内注射麻醉，股动脉抽血4～6 ml，室温静置30 min后3 000 r/min离心15 min，用吸液管取血清，置于冻存管-20℃冰箱待测。④放射酶联免疫学方法(ELISA)测定血清 IL-1β、IL-1、TNF-α 水平(严格按照说明书操作)⑤取CIA大鼠右膝关节滑膜及部分软骨放于4%甲醛固定，8%EDTA溶液脱钙，常规梯度脱水、浸蜡、包埋、切片，HE染色。光镜下观察普通病理变化。

1.8 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件分析，计量资料采用s表示，符合正态分布和方差齐性组间比较应用单因素方差分析，不符合正态分布的组间比较应用多个样本的非参数检验。

2 结果

2.1 一般情况变化 空白组大鼠随着饲养时间的延长，体重增加、活动自如、皮毛光泽、精神状态良好，无异常状态出现。模型组大鼠毛发干枯无光泽、饮食量及饮水量减少、精神萎靡，后期可见行走困难及关节活动障碍等。雷公藤多苷组及金乌健骨方各剂量组大鼠的饮食情况、精神状态及关节活动障碍均较模型组好。

2.2 体重变化及左后足踝关节容积比较 造模前，各组大鼠体重关节大小无差异(P＞0.05)，灌胃2 w后体重比较，与空白组大鼠比较，模型组、雷公藤多苷组及金乌健骨方低、中、高剂量组大鼠体重增长减慢，灌胃4 w后模型组体重增长明显低于空白组(P＜0.05)，见表1。关节肿胀于造模后4～5 d出现，模型组大鼠于第3周关节肿胀达到高峰，治疗组大鼠均于第2周左右达到高峰，以后逐渐降低，其降低速度明显快于模型组大鼠(P＜0.05)，金乌健骨方各剂量组比较，低、中剂量间无显著性差异，而与高剂量间有极显著性差异，表明用金乌健骨方3个剂量治疗后，中、高剂量呈现剂量依赖性抑制佐剂性关节炎大鼠的足肿胀。见表2。

2.3 各组血清 IL-1β、IL-1、TNF-α水平 模型组大鼠血清中IL-1、IL-1β、TNF-α 值与空白组相比升高(P＜0.01)，说明造模成功;经金乌健骨方3个剂量及雷公藤治疗后，IL-1β、IL-1、TNF-α水平均较模型组显著减低(P＜0.05)。其中TNF-α在金乌健骨方低、中、高3个剂量中表达呈减少趋势，表明金乌健骨方对CIA的TNF-α免疫抑制作用随剂量增加而加强，并且在短时间内持续抑制。金乌健骨方对CIA大鼠的IL-1、IL-1β表达水平的影响与剂量关系无明显的规律性。见表3。

2.4 金乌健骨方对CIA大鼠膝关节滑膜、软骨病理的影响

空白组大鼠膝关节滑膜组织光滑完整，无炎细胞浸润、血管增生及纤维素渗出。模型组滑膜组织可见明显的血管增生、增厚、炎细胞浸润、水肿，软骨组织增生;随着关节症状的加重，滑膜组织新生血管逐渐增多、血管扩张、充血，大量淋巴细胞浸润。金乌健骨方高剂量组与雷公藤多苷组滑膜组织可见少量新生，未见骨小梁结构改变。金乌健骨方中剂量组可见少量新生血管及滑膜增生，少量炎细胞浸润、水肿，软骨轻度增生，少数关节软骨破坏。金乌健骨方低剂量组可见明显新生血管及滑膜增生、炎细胞浸润、水肿，软骨轻度增生及关节软骨破坏程度较金乌健骨方中剂量组重。见图1。

表1 各组大鼠体重变化(s，n=10)

表1 各组大鼠体重变化(s，n=10)

与空白组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与模型组比较:3)P＜0.05，4)P＜0.01，下表同

组别 造模前1 d 灌胃2 w后 灌胃4 w后空白组 180.6±16.7 247.2±17.5 307.9±38.7模型组 178.9±14.4 209.9±19.41) 235.9±23.42)雷公藤多苷组 164.8±18.8 237.2±28.83) 274.3±18.93)金乌健骨方低剂量组 170.1±24.0 225.3±24.0 263.9±21.71)金乌健骨方中剂量组 168.8±18.2 221.8±22.2 285.1±19.33)金乌健骨方高剂量组 179±16.33) 241±11.23) 301.2±25.64)

图1 各组大鼠关节滑膜组织病理(HE，×10)

表2 各组大鼠关节容积变化(s，n=10)

表2 各组大鼠关节容积变化(s，n=10)

组别 造模前1 d 灌胃2 w后 灌胃4 w后空白组 0.24 1.6 4.16 2.0 8.31 1.7模型组 0.27±1.9 35.0±5.92) 47.5±5.22)雷公藤多苷组 0.26±1.3 24.2±7.33) 11.7±4.64)金乌健骨方低剂量组 0.25±1.2 28.7±6.71) 25.1±2.32)3)金乌健骨方中剂量组 0.26±1.0 23.7±7.31)3) 17.3±3.71)3)金乌健骨方高剂量组 0.25±1.3 23.6±8.01)3) 10.2±1.74)

表3 各组IL-1β、IL-1、TNF-α水平比较(s，n=10)

表3 各组IL-1β、IL-1、TNF-α水平比较(s，n=10)

空白组 29.40±4.41 81.31±6.34 176.40±40.41模型组 69.15±5.852)138.37±4.541)380.15±83.852)雷公藤多苷组 36.59±3.273) 84.24±5.563)262.96±55.101)3)金乌健骨方低剂量组 32.97±4.21 99.38±6.323)334.02±38.182)金乌健骨方中剂量组 31.12±3.343) 87.33±7.783) 254±58.291)4)金乌健骨方高剂量组 32.17±2.384) 85.24±4.053) 189±38.104)

3 讨论

RA是以对称性多关节炎为主要临床表现的慢性、进行性、侵袭性疾病，进行性的关节结构破坏时其病理学的主要特点，病理变化主要为关节滑膜的慢性炎症，初期滑膜充血、水肿、增厚，血管翳形成，软骨和软骨下骨破坏。属中医“痹证”、“历节”、“尪痹”范畴，本病的发生多以肝肾亏虚、筋骨失养、寒湿或湿热入络为主要病机，治疗应以祛风湿、通经络、补肝肾、强筋骨为主。金乌健骨汤中金毛狗脊、乌梢蛇有补肝肾、强腰脊、祛风湿、通经活血之效，千年健、小花青风藤、黑骨藤祛风止痛、强筋健骨，三七、姜黄活血止痛;白芍养血，缓急止痛，全方具有温肾助阳、散寒通络、活血止痛之功效。从补肾、强筋、健骨、活血、养血、祛风、通络、定痛等多角度组方，形散而力专，配合精当。

本实验观察证明CIA大鼠具有与RA相似的慢性、反复发病的特点。本文结果说明金乌健骨方能控制CIA大鼠踝关节肿胀，对大鼠CIA有明显的治疗作用。关节滑膜是RA发病的靶器官，成纤维样滑膜细胞是滑膜组织的重要组成部分，其分泌高水平促炎性细胞因子、化学趋化因子、基质蛋白降解酶等，持续刺激滑膜细胞，导致滑膜细胞的增殖与凋亡失衡，可诱发滑膜细胞增殖的刺激因素主要包括IL-1β，IL-1，TNF-α等。其中IL-1是一种重要的炎性细胞因子，它参与调节机体的免疫应答，炎症等许多的过程，在慢性炎症中IL-1的调节障碍、延迟合成以及释放都会导致一些疾病的发生。IL-1包括IL-1a和IL-1β，IL-1、IL-1β能作用于内皮细胞促进嗜中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞聚集，引起RA关节局部炎症反应发生。TNF-α是RA发病机制中处于重要地位的促炎性细胞因子，参与了RA多种致病机制，包括内皮细胞的激活、细胞因子的诱导、白细胞的聚集、破骨细胞的活化与软骨的破坏等〔4〕。本实验结果显示，金乌健骨方治疗组显著抑制了IL-1β、IL-1、TNF-α的表达，对CIA大鼠有显著的治疗作用。

1 马武开，钟 琴，姚血明.苗药金乌健骨汤治疗类风湿关节炎的临床观察〔J〕.中华中医药杂志，2010;25(12):2190-2.

2 马武开，钟 琴，姚血明，等.苗药金乌健骨汤对MTX治疗类风湿关节炎耐药患者增效作用研究〔J〕.中医杂志，2010;51(5):61.

3 徐叔云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学〔M〕.第3版.北京:人民卫生出版社，2002:920.

4 陈如平，王昌兴，王伟东，等.类风湿性关节炎中肿瘤坏死因子-α的表达及意义〔J〕.医学综述，2011;17(5):647-9.