盐酸氨溴索缓释混悬剂在犬体内的生物等效性研究

2014-12-03尹飞刘宏飞师双双潘卫三辽宁省肿瘤医院药学部沈阳110042沈阳药科大学药学院沈阳110016江苏大学药学院江苏镇江21201

中国药房 2014年5期

尹飞，刘宏飞，师双双，潘卫三（1.辽宁省肿瘤医院药学部，沈阳110042；2.沈阳药科大学药学院，沈阳110016；.江苏大学药学院，江苏镇江 21201）

盐酸氨溴索（Ambroxol hydrochloride，AH）作为呼吸系统祛痰药的首选药物已被广泛研究，并已有多种剂型上市。但尚未有AH液体缓释制剂的研究，如能将其制备成液体缓释制剂，将会增加其适用人群（婴幼儿、老年患者），提高患者服用的顺应性（易于服用、便于分剂量等）[1-2]。笔者自制了AH缓释混悬剂，采用高效液相色谱（HPLC）法作为检测方法，对AH缓释混悬剂在犬体内的药动学特征及与市售AH缓释胶囊的生物等效性进行了研究，为其临床研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

HPLC仪，包括LC-10A型输液泵、SPD-10A型紫外检测器（日本岛津公司）；TG328B电光分析天平（上海天平仪器厂）；MD200-2电光分析天平[奥豪斯国际贸易（上海）有限公司]。

1.2 药品与试剂

AH对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100599-201203，纯度：99.9%）；受试制剂：AH缓释混悬剂（沈阳药科大学药学院自制，批号：20120601，规格：75 mg∶10 ml）；参比制剂：AH缓释胶囊（常州第四制药厂，批号：H20124211，规格：每粒75 mg）；内标盐酸丁咯地尔（原料药，齐鲁制药有限公司，批号：20120326，纯度：99.94%）；氢氧化钠、乙醚、盐酸均为分析纯，乙腈和甲醇均为色谱纯，水为纯化水。

1.3 动物

健康Beagle犬6条，♀♂各半，体质量12～15 kg，由沈阳药科大学动物实验室提供，使用许可证号：SYXK（辽）2003-0012。

2 方法与结果

2.1 实验设计

采用两制剂双周期试验设计。取犬6只，禁食12 h后分别灌服参比制剂或受试制剂75 mg，自由饮水，给药4 h后统一进食，间隔时间为1周。在犬前肢静脉处安置留置针，于给药前取空白血，给药后1、2、3、4、5、6、8、10、12、14、24 h取样品血5 ml，肝素抗凝，立即3000 r/min（离心半径13.5 cm，下同）离心10 min，分离出血浆，于－20℃下保存，待分析。

2.2 血浆样品的处理[3-6]

取犬血浆1 ml，置于10 ml具塞玻璃试管中，加入50 μl内标水溶液（盐酸丁咯地尔10 μg/ml），旋涡混匀30 s，加入0.01 mol/L的氢氧化钠溶液0.5 ml，涡旋混匀30 s，加入乙醚5 ml，封口后旋涡混匀3 min，4000 r/min离心8 min；分取醚层4 ml至另一支10 ml具塞玻璃试管中，再加入0.03 mol/L的盐酸溶液200 μl，涡旋混匀3 min，4000 r/min离心8 min；弃去醚层；取酸层20 μl注入HPLC仪进行分析。

2.3 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-乙腈-0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 5.3）-三乙胺（100∶100∶100∶0.04），流速：1.0 ml/min；检测波长：307 nm；进样量：20 μl；温度：35 ℃。分别取空白血浆、空白血浆+AH+内标、血浆样品+内标，按“2.2”项下方法处理后进样测定，色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图A.空白血浆；B空白血浆+AH+内标；C.血浆样品+内标；1.AH；2.内标Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+AH+internal standard；C.plasma sample+internal standard；1.AH；2.internal standard

2.4 标准曲线的制备

精密称取AH对照品适量，配制成0.5、1、2、5、10、25 μg/ml的对照品溶液。精密量取空白血浆0.9 ml，置于10 ml具塞玻璃试管中，分别精密加入上述对照品溶液100 μl制成含AH 0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.5 μg/ml的血浆样品，按“2.2”项下方法处理后进样测定，记录色谱。以AH与内标的峰面积比值（y）为纵坐标、AH的质量浓度（x）为横坐标进行线性回归，得标准曲线方程为y＝1.345x+0.006（r＝0.9995），AH检测质量浓度的线性范围为0.05～2.5 μg/ml。信噪比为3时，检测限为0.12 ng；信噪比为10时，定量限为0.4 ng。

2.5 方法回收率与提取回收率考察

按“2.4”项下方法制备含AH 0.05、0.5、2.5 μg/ml的血浆样品，按“2.2”项下方法处理后进样测定，记录峰面积，代入标准曲线方法计算质量浓度，与样品质量浓度的比值计算方法回收率；另取质量浓度为 0.05、0.5、2.5 μg/ml的AH水溶液，进样测定峰面积，记录色谱图和峰面积，以相应质量浓度血浆样品峰面积与AH水溶液峰面积的比值计算提取回收率，重复5次。回收率试验结果见表1。

表1 回收率与精密度试验结果（n＝5）Tab 1Results of recovery and precision tests（n＝5）

2.6 日内精密度与日间精密度考察

精密量取空白血浆0.9 ml，置于10 ml具塞玻璃试管中，分别精密加入100 μl“2.4”项下对照品溶液制备成的含AH分别为0.05、0.5、2.5 µg/ml的血浆样品，按“2.2”项下方法处理后进样测定，记录峰面积，代入标准曲线方程计算质量浓度。同日内每一质量浓度测定5次考察日内精密度；每日测1次，连续测定5 d考察日间精密度，结果见表1。

2.7 药动学研究

2.7.1 药动学参数。取“2.1”项下各犬的血浆，按“2.2”项下方法处理、进样测定，记录峰面积，按内标法代入标准曲线方程计算质量浓度，绘制两种制剂在犬体内的药-时曲线，见图2。

图2 两种制剂在犬体内的药-时曲线Fig 2 Mean plasma concentration-time curves of 2 kinds of preparations in Beagle dogs

由于参比制剂与受试制剂均为缓释制剂，不能直接由3p87程序判断隔室模型，根据研究资料确立AH的隔室模型为单室模型[7-9]。采用非隔室模型计算两种制剂的药动学参数，结果见表2。

表2 两种制剂在犬体内的药动学参数（±s，n＝6）Tab 2 Pharmacokinetic parameters of 2 kinds of preparations in Beagle dog（s±s，n＝6）

药动学参数t1/2，h tmax，h cmax，μg/ml AUC0-24 h，μg· h/ml AUC0-∞，μg· h/ml MRT，h参比制剂4.48±0.224.33±0.522.06±0.1820.55±1.3821.33±1.378.86±0.21受试制剂4.21±0.155.00±0.001.90±0.2721.70±3.1122.49±3.199.28±0.11

2.7.2 生物等效性与生物利用度判定。对表2中数据进行双单侧t检验，结果受试制剂的AUC0-24h有90%可信区间在参比制剂AUC0-24h的96.6%～113.8%内；受试制剂的cmax有90%可信区间在参比制剂cmax的88.9%～106.5%内，表明受试制剂与参比制剂有生物等效性。受试制剂针对参比制剂的相对生物利用度为105.2%。

2.7.3 体内外相关性。AH口服属于单室模型，采用W-N法计算不同时间的吸收分数（Fa），以体外累积释放百分率（F）为自变量、体内Fa为应变量，进行最小二乘法线性回归，求得相关方程和相关系数（r），判定体外释放与体内吸收的相关性。结果回归方程为Fa＝1.7035F－0.1409（r＝0.9121），表明体内外相关性较好。