刘 涛，张晓敏，郑红艳，万升标

（中国海洋大学医药学院，山东 青岛 266003）

二氢杨梅素（3，5，7，3’，4’，5’-六羟基-2，3-双氢黄酮醇，Dihydromyricenin）广泛存在于葡萄科蛇葡萄属植物中［1］，尤其在显齿蛇葡萄植物的幼嫩茎叶中含量更高［2］。药理研究表明，二氢杨梅素具有消炎、抑菌、止咳、阵痛、消脂［3］及抗脂质、保肝护肝、抗高血压、抗肿瘤、清除自由基、增强人体免疫力等［4］功效。文献报道对二氢杨梅素进行衍生化亦能发现更好的活性化合物。Matsumoto等发现甲基化的二氢杨梅素对ladosporium真菌抑菌能力是二氢杨梅素的4倍［5］；二氢杨梅素乙酸酯、硬脂酸酯和月桂酸酯具有较好的抗氧化作用［6－8］；5-氟尿嘧啶乙酸与二氢杨梅素酯化衍生物对K562和K562/ADR肿瘤细胞有较强的抑制作用［9］。随着二氢杨梅素生物活性研究和衍生化越来越受到重视，高纯度的二氢杨梅素需求增加，而市售分析纯二氢杨梅素价格昂贵。因二氢杨梅素有2个手性碳，故全合成方法较复杂。从天然植物中提取纯化二氢杨梅素是简单经济的方法。国内外有部分研究报道利用有机溶剂提取法和大孔吸附树脂提取法［10－11］从藤茶提取物中提取得到二氢杨梅素。而关于二氢杨梅素纯化方面的研究则较少。有报道用重结晶法和层析分离法［12］制备高纯度二氢杨梅素。层析技术分为吸附树脂和高效液相制备技术等。高效液相色谱及高效逆流色谱分离法单次分离的样品量少，而重结晶法存在试剂消耗大且收率低的缺点，因此这两种方法均不合适工业化生产。目前，尚未有大规模工业生产高纯度二氢杨梅素的报道。

为确定二氢杨梅素提纯工艺以及藤茶提取物中组分，本文结合实验室前期表没食子儿茶素没食子酸酯的化学精制方法［13］，以及二氢杨梅素多酚羟基保护基脱除难易程度设计了甲基化－去甲基化和乙酰化－去乙酰化两条纯化路线，运用甲基化－去甲基化方法以较高产率制备了二氢杨梅素，并确定了藤茶提取物中主要成分构成。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

藤茶提取物（二氢杨梅素纯度为90%，陕西杨凌东科麦迪森制药有限公司）；二氢杨梅素对照品（含量＞99%，Alfa公司），其余试剂均为市售分析纯产品，除特别说明外，不经处理直接使用。

WRX-1S型显微熔点仪（温度计未经校正）；JEOL JNM-EPC 600核磁共振光谱仪（内标为TMS）测1H，13CNMR；Q-TOF Ultima TMGLOBAL质谱仪。

1.2 化合物的制备

1.2.1 2 -（3′，4′，5′-三甲氧基）-3-羟基-5，7-二甲氧基-色稀-4-酮（1） 在500mL反应瓶中加入 DMF（100 mL）、藤茶提取物（12g）及碳酸钾（30g），搅拌0.5h，冰盐浴条件下恒压滴加碘甲烷（12mL，0.19mol），0℃反应2h后室温反应22h。经薄层色谱检测反应完全后，在搅拌下将反应液倒入400mL冰水中，二氯甲烷（3×100mL）萃取，收集有机相，饱和食盐水（3×100 mL）洗3次，蒸馏水（3×100mL）洗3次，无水硫酸镁干燥，旋转蒸发除去溶剂，得到咖啡色固体。硅胶柱层析（V乙酸乙酯∶V石油醚＝1∶2）得到化合物1，产率为17.2%。mp：232～234°C；1H NMR （CDCl3，600 MHz）δ（ppm）：7.48（s，2H），6.54（d，J＝2.2Hz，1H），6.36（d，J＝2.2Hz，1H），3.98～3.92（4s，15H）；13C NMR（CDCl3，150MHz）δ：172.1，164.6，160.7，158.9，153.3，141.8，139.6，138.1，126.4，106.3，105.0，95.84，92.54，77.31，77.01，76.88，61.07，56.50，56.41，55.97.HRMS：m/zcacld for C20H20O＋8389.123 1；found：389.123 2。

图1 二氢杨梅素的纯化路线Fig.1 The purification route of dihydromyricenin

1.2.2 2 -（3’，4’，5’-三甲氧基）-2，5，7-三甲氧基-色满-4-酮 （2） 以藤茶提取物为原料，制备方法同化合物1，产率8.9%。mp：86～89°C；1H NMR（CDCl3，600MHz）δ（ppm）：6.44（s，2H），6.03（d，J＝1.9 Hz，1H），5.89（d，J＝1.9Hz，1H），3.85～3.75（4s，15H），3.17（d，J＝14.3Hz，1H），3.06（d，J＝14.3Hz ，1H）；13C NMR （CDCl3，150MHz）δ（ppm）：193.24，173.55，170.77，158.92，152.60，135.89，129.02，109.52，107.81，104.71，92.73，88.58，77.37，77.16，76.95，60.78，56.09，52.22，41.79。HRMS：m/zcacld for C21H24405.154 4；found：405.154 3。

1.2.5 （2R，3R）-2-（3’，4’，5’-乙酰氧基苯基）-3，5，7-三乙酰氧基-色满-4-酮（5） 在100mL反应瓶中加入乙酸酐（30mL，317.4mmol）、吡啶（30mL，372.7mmol），冰盐浴冷却至0℃，搅拌下缓缓加入藤茶提取物10g，搅拌30min后，室温下继续搅拌反应36h。经薄层色谱检测反应完全后，搅拌下将反应液倒入约50mL冰水中，二氯甲烷（20mL×3）萃取3次，分离有机相，有机相分别用稀盐酸（20mL，0.1mol/L）和蒸馏水（20mL）各洗3次。有机相用无水MgSO4干燥，旋转蒸发除去溶剂，得到淡黄色粘稠固体。硅胶柱层析（V乙酸乙酯∶V石油醚＝1∶3）得1.9g白色晶体化合物5，产率为11.8%。mp：191～193℃；1H NMR（CDCl3，600MHz）δ（ppm）：7.24 （s，2H），6.79（d，J＝2.2 Hz，1H），6.60（d，J＝2.2Hz，1H），5.59（d，J＝12.1Hz，1H），5.43（d，J＝12.1Hz，1H），2.36（s，3H），2.29～2.28（3s，12H）；13C NMR （CDCl3，150 MHz）δ（ppm）：184.83，169.24，167.96，167.73，166.87，162.19，156.55，143.61，135.41，133.32，119.85，110.67，109.19，80.12，73.22HRMS：m/zcacld for C27H24573.123 9；found：573.123 40。

1.2.6 2 -（3’，4’，5’-三乙酰氧基苯基）-6-羟基-3，7-二乙酰氧基-色满-4-酮 （6） 以藤茶提取物为原料，制备方法同化合物5，产率29.5%。mp：187～189°C；1H NMR （CDCl3，600MHz）δ（ppm）：11.24 （s，1H），7.24（s，2H），6.36（s，1H），6.32（s，1H），5.46（d，1H），5.40 （d，1H），2.30（s，3H），2.29（s，3H），2.28 （s，9H），2.12（s，3H）；13C NMR（CDCl3，150MHz）δ（ppm）：192.52，169.41，168.19，167.74，166.87，163.34，161.27，158.99，143.67，135.43，133.20，119.79，105.04，104.43，102.22， 80.09， 72.65， 21.30， 20.79， 20.34。HRMS：m/zcacld for C25H22553.095 3；found：553.095 0。

2 结果与讨论

2.1 提纯工艺的确定

本文设计了2种分离提纯二氢杨梅素的工艺并进行实验对比，制备方法线路如图1所示。对藤茶提取物进行甲基化，用柱层析分离得到了全甲基化杨梅素1、化合物2和五甲基化二氢杨梅素3，3种产物极性相差较大，易用柱色谱进行分离，且运用三溴化硼脱除甲基制备二氢杨梅素的反应操作简便、成本较低且收率高；尝试对藤茶提取物进行乙酰化，因产物极性相差较小，利用柱色谱分离仅得到五乙酰化二氢杨梅素6和部分全乙酰化二氢杨梅素5。而大部分全乙酰化二氢杨梅素5与其他组分极性相近而无法全部分离提纯，因此产率很低。同时在利用乙酰氯脱乙酰氧基制备二氢杨梅素实验中发现，全乙酰化二氢杨梅素3位乙酰基不能被除去，因此该路线不适合制备高纯度二氢杨梅素。此外本文还设计了苄基化－去苄基的纯化路线，但对藤茶提取物进行苄基化后，得到的产物极性相近，运用柱层析无法分离得到高纯度苄基化二氢杨梅素。综上所述，选择甲基化－去甲基化纯化路线可用作制备高纯度二氢杨梅素。

2.2 化合物2和化合物6的结构确证

化合物2是全新化合物，为本文首次报道。通过与其结构类似物2－羟基柚皮素-5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和化合物3的核磁信息对比确证［14］化合物2为2-（3’，4’，5’-三甲氧基）-2，5，7-三甲氧基－色满-4-酮。

通过对比化合物5与化合物6的高分辨质谱与氢谱发现化合物5比化合物6多一个乙酰基，化合物5只有A环的6-H和8-H化学位移与化合物6A环的6－H和8-H化学位移不同，其余氢的化学位移相似，说明化合物6有一个酚羟基未被乙酰化；在化合物6氢谱的化学位移11.2处有一单峰，推测原因是5位羟基与4位羰基形成分子内氢键，使得5位羟基氢的化学位移向低场移动，另通过与其结构类似物2-（3’，4’-二乙酰氧基苯基）-6-羟基-3，7-二乙酰氧基－色满-4-酮的核磁信息［15］对比确证化合物6为2-（3’，4’，5’-三乙酰氧基苯基）-6-羟基-3，7-二乙酰氧基－色满-4-酮。

2.3 化合物3和化合物4立体构型的确定

3 结语

本文通过甲基化－去甲基化反应制备了二氢杨梅素纯品，总产率达到12.2%。本文从藤茶提取物中分离得到所有化合物结构均经熔点、核磁共振氢谱、碳谱和质谱确认。

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