李红英，陈红霞，汪 蕾

(1.湖北省妇幼保健院，湖北 武汉430070;2.湖北科技学院基础医学院，湖北 咸宁437100;3.湖北中医药大学检验学院，湖北武汉430065)

对已形成的肿瘤而言，肿瘤微环境缺乏有效的抗肿瘤免疫应答［1］。近年研究发现，部分促凋亡的药物不仅能直接损伤肿瘤细胞，还能诱导肿瘤细胞在膜表面暴露钙网织蛋白等免疫原性相关分子，促进树突状细胞(DC)成熟，从而活化肿瘤抗原特异性T细胞［2］，重建肿瘤微环境中特异性的抗肿瘤免疫。卡铂是治疗卵巢癌的一线用药，虽然能诱导肿瘤细胞凋亡，但无法诱导免疫原性分子的表达［3］。因此寻找其他能激活肿瘤免疫原性的药物有助于抗肿瘤免疫。紫草素是传统中药提取物，具有诱导凋亡等多种生物学活性［4］。但是能否增强卵巢癌细胞的免疫原性有待研究。本研究通过紫草素诱导卵巢癌细胞凋亡，观察凋亡癌细胞上调DC表达成熟相关膜分子CD86的作用及其与癌细胞膜表面钙网织蛋白(CRT)的关系，为临床上建立化疗诱导的卵巢癌免疫治疗提供实验依据。

1 实验资料

1.1 试剂和细胞系 人卵巢癌HO-8910细胞系由湖北科技学院基础医学院冻存。紫草素(S7576，纯度≥98%)购自Sigma公司，1640培养基、DMEM培养基和胎牛血清(FCS)购自Gibco公司。人淋巴细胞分离液Ficoll(C1077)购自北京普利莱有限公司。PE标记的抗人CRT流式抗体(83220)购自美国 Abcam公司，FITC标记的抗人 CD1α流式抗体(300104)、PE标记的抗人CD86流式抗体(305406)、rhGMCSF(572902)和rhlL-4(574002)均购自美国Biolegend公司，凋亡检测试剂盒(AnnexinⅤ-FITC/PI，KGA107)购自南京凯基生物科技发展有限公司。钙网织蛋白抑制性多肽(CRT inhibitor，3077BP-50)购自美国 Biovision公司。

1.2 仪器 流式细胞仪(BD LSR-Ⅱ，美国BD公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 卵巢癌HO-8910细胞培养以及紫草素处理细胞在37℃含5%CO2的空气培养箱，卵巢癌HO-8910细胞加入含10%FCS的1640，取处于生长对数期的细胞经胰蛋白酶消化洗涤后以1×109L-1的密度接种于6孔板，每孔加入DMEM完全培养基3 mL。实验分为不同浓度(1 μmol/L、2.5 μmol/L以及5 μmol/L)紫草素处理组和未加入紫草素的对照组。紫草素用DMSO溶解后用培养基稀释至终浓度，DMSO的终浓度为0.1%;对照组培养基中含有0.1%DMSO。48 h消化收集细胞以300 g离心5 min，用于后续实验。

1.3.2 流式细胞术检测细胞凋亡率 收集1.3.1中各组HO-8910细胞用PBS洗2遍，将细胞以5×108L-1的浓度重悬500 μL 的 Binding Buffer 悬浮细胞，加入 10 μL Annexin VFITC和5 μL Propidium Iodide混匀，室温下避光反应15 min，随后应用流式细胞仪检测细胞凋亡率，Annexin V单阳性细胞占所有细胞的比例即为凋亡率。

1.3.3 流式细胞术检测细胞膜表面钙网织蛋白的表达 收集1.3.1中各组HO-8910细胞用 PBS洗2遍，取5×108L-1细胞重悬于200 μL的PBS中，加入20 μL PE标记的钙网织蛋白抗体，4℃烫避光30 min，PBS洗涤2次，再重悬于500 μL的PBS进行流式细胞仪检测。

1.3.4 人外周血单个核细胞分离以及树突状细胞培养 外周血来自于湖北武汉血液中心的健康自愿献血者。取经过抗凝处理的外周静脉血，按以下比例加入各种试剂:每10 mL外周血加入10 mLPBS混匀后轻轻加在10 mL的(Ficoll)分离液上层，在室温下400 g离心30 min。小心吸取白膜层后加入10 mL的PBS，以200 g离心10 min，弃上清后重复洗涤3次。计数得到单个核细胞在12孔板中用含10%FCS的1640培养液重悬。每孔密度为2×109L-1，培养体系为2 mL，2 h后去除悬浮细胞，加入 rhGM-CSF(100 μg/L)和 rhlL-4(100 μg/L)以及10%FCS的1640培养液。隔天半量换液，补加细胞因子至上述浓度。8 d后收集细胞为人外周血来源DC。

1.3.5 卵巢癌HO-8910细胞与DC的混合培养 将1.3.1中各组HO-8910细胞和1.3.4中得到的DC在24孔板中进行混合培养。HO-8910细胞 (4×105cells/孔)，DC(2×105cells/孔)，培养体系为 500 μL/孔。分别分为(1 μmol/L、2.5 μmol/L以及5 μmol/L)紫草素干预HO-8910细胞+DC组;(1 μmol/L、2.5 μmol/L 以及5 μmol/L)紫草素干预 HO-8910细胞+DC组+钙网织蛋白抑制性多肽(CRT inhibitor)组、未经紫草素干预HO-8910细胞+DC组(对照组)、未经紫草素干预HO-8910细胞+DC组+CRT inhibitor组、DC组(空白组)以及DC+CRT inhibitor组。24 h后半量换液1次，48 h后收集各组细胞进行DC免疫表型检测。

1.3.6 流式细胞术检测DC膜表面CD1α和CD86的表达收集1.3.5中各组混合培养的细胞用PBS洗2遍，取5×108L-1细胞重悬于 200 μL PBS 中，加入10 μL FITC 标记的 CD1α抗体，10 μL PE标记的CD86抗体4℃烫避光孵育30 min后PBS洗涤2次，再重悬于500 μL PBS。随后上机进行流式细胞检测，以CD1α单阳性的细胞圈门进行分析，CD1αCD86双阳性细胞占CD1α单阳性细胞的比例即为DC表达CD86的阳性率。

1.4 统计学处理 应用统计软件SPSS 13.0进行数据的统计分析，所有实验数据以均数±标准差(±s)表示，组间均数比较用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 紫草素诱导卵巢癌HO-8910细胞发生凋亡情况 HO-8910细胞经紫草素作用48 h后，细胞凋亡率与未经紫草素处理的对照组比较有显著性差异(P＜0.01)，并且细胞凋亡率与紫草素之间存在浓度依赖性。见图1。

图1 流式细胞术测定各组HO-8910细胞凋亡率

2.2 紫草素诱导卵巢癌HO-8910细胞膜表面表达钙网织蛋白 HO-8910细胞经紫草素作用48 h后，细胞膜表面的钙网织蛋白表达率显著上调，与未经紫草素处理的对照组比较有显著性差异(P＜0.01)，并且细胞膜表面钙网织蛋白的表达率与紫草素之间存在浓度依赖性。见图2。

图2 流式细胞术测定各组HO-8910细胞钙网织蛋白表达率

2.3 卵巢癌HO-8910细胞通过膜钙网织蛋白促进DC上调CD86表达 从外周血分离培养的 DC，纯度在80%以上(CD1α阳性率＞80%)。与HO-8910细胞混合培养的各组DC其CD86阳性率均高于空白组DC(未经过混合培养)(P＜0.01);在混合培养的各组中，与经过紫草素干预的 HO-8910细胞混合培养的DC其CD86阳性率均高于与未经过紫草素干预的HO-8910细胞混合培养的对照组DC(P＜0.01);而且随着干预HO-8910细胞的紫草素浓度升高，与之混合培养的DC表达CD86阳性率增加。为了进一步探讨HO-8910细胞刺激DC上调CD86表达与膜表面CRT的关系，在各组中加入CRT抑制性多肽(CRT inhibitor)。结果显示CRT inhibitor均显著抑制了与经过紫草素处理的HO-8910细胞混合培养的DC上调表达CD86(P＜0.01);但是在对照组(与DC混合培养的HO-8910细胞未经过紫草素处理)和空白组(未加入HO-8910细胞)，CRT inhibitor对于DC表面CD86的表达均无影响(P＞0.05)。见图3。

图3 流式细胞术测定各组DC细胞膜表面CD86分子表达率

3 讨 论

近年研究发现，一些细胞毒性的药物在诱导癌细胞凋亡的同时促使癌细胞膜表面表达CRT和HSP70等DC所识别的分子，通过与DC表面的配体相互作用，促进DC吞噬并提呈肿瘤抗原，进而刺激机体形成特异性致敏淋巴细胞，有助于重建肿瘤局部的免疫格局［5］。本实验显示紫草素诱导卵巢癌细胞凋亡的同时促使其在膜表面上调CRT表达，并且与人外周血来源的DC混合培养后促使DC上调其成熟标志之一膜分子CD86。

CRT是存在于内质网中的钙结合蛋白，参与蛋白质合成期间的折叠，并且通过绑定Ca2+增加内质网中的Ca2+稳定性［6］。新近研究发现，在凋亡期间CRT转移到细胞膜表面能为DC以及其他吞噬细胞提供“eat-me”信号。敲除CRT蛋白后，凋亡细胞诱导DC活化等免疫反应亦随之消失［7］。因此CRT的膜转位可以加强死亡癌细胞的免疫原性。但是不同的促凋亡药物诱导细胞免疫原性的差异很大，其机制不明。目前未发现治疗卵巢癌的一线用药铂类能促使CRT等免疫原性分子上调。因此，配伍使用诱导癌细胞免疫原性死亡的药物将有助于机体的抗肿瘤免疫。本研究发现中药紫草的有效化学成分紫草素诱导卵巢癌细胞凋亡率的同时膜表面CRT显著升高，并且呈浓度依赖性。

DC是体内重要的抗原提呈细胞，是特异性免疫应答的启动者，DC识别癌细胞并提呈肿瘤抗原对于触发T细胞依赖的抗肿瘤免疫至关重要。未成熟的DC吞噬抗原后分化为成熟的DC，高表达共刺激分子CD80和CD86，这两种分子亦是DC成熟的标志之一［8］。CD86的表达要早于CD80，因此本实验选择CD86作为一个成熟的早期标志，并且观察到卵巢癌细胞与DC混合培养后，随着癌细胞CRT阳性率上升，DC表达CD86阳性率亦上调，在加入CRT抑制性多肽后能显著抑制上述效应，表明CRT在卵巢癌细胞促使DC成熟的过程中起了显著作用。但是CRT抑制性多肽并不能完全抑制CD86的表达上调，而且与空白组相比，未发生凋亡的癌细胞亦能促使DC的CD86出现一定程度的上调。说明癌细胞尚存在促使DC成熟的多种机制，有待进一步的研究。

目前针对卵巢癌的化疗虽然能直接损伤肿瘤细胞，但不能彻底杀伤肿瘤细胞。清除残留的癌细胞仍有赖于机体重建有效的特异性抗肿瘤免疫。在本实验中，发现传统中药的提取物紫草素能增强癌细胞的免疫原性，从而为临床上建立化疗诱导的卵巢癌免疫治疗提供了实验依据。

［1］黄波，沈关心.抗肿瘤免疫的新策略:揭开环磷酰胺未知的面纱［J］.中国肿瘤，2011，20(2):98-99

［2］Erika V，Laura S，Alexander E，et al.Chemotherapy with immunogenic cell death inducers［J］.OncoImmunology，2013，2(3):5101-5111

［3］Dmitri VK，Abhishek DG，Agnieszka K，et al.Immunogenic cell death and DAMPs in cancer therapy［J］.Nature Reviews Cancer，2013，12(1):860-875

［4］陈菊英，刘朝纯，曾智，等.紫草素通过PI3K/Akt通路促进人乳腺癌 MCF-7细胞自噬［J］.中国药理学通报，2013，29(2):194-820

［5］Jitka F，Petra K，Anna F，et al.Human tumor cells killed by anthracyclines induce a tumor-specific immune response［J］.Cancer Res，2011，7(1):4821-4833

［6］Michel O，Antoine T，François G，et al.，Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death［J］.Nat Med，2007，13(10):54-61

［7］Sukkurwala AQ，Martins I，Wang Y，et al.Immunogenic calreticulin exposure occurs through a phylogenetically conserved stress pathway involving the chemokine CXCL8［J］.Cell Death ＆ Differentiation，2013，6(2):54-61

［8］Chihiro Y，Masanaka S，Tomokazu O，et al.Critical roles of a dendritic cell subset expressing a chemokine receptor，XCR1［J］.J Immunol，2013，19(12):6071-6082