高春燕，高庆双，刘树平，许林骥，王晶晶，郑建霞

(唐山市妇幼保健院 检验科， 河北 唐山 063000)

研究论文

唐山地区福氏志贺菌超广谱β-内酰胺酶基因型和同源性的分析

高春燕*，高庆双，刘树平，许林骥，王晶晶，郑建霞

(唐山市妇幼保健院 检验科， 河北 唐山 063000)

目的了解唐山地区福氏志贺菌的耐药特征，明确其所携带超广谱β内酰胺酶(ESBLs)的基因型和菌株之间的相关性。方法用纸片扩散法作ESBLs确证试验；对产ESBLs的菌株用微量肉汤稀释法测定其MICs；用PCR扩增ESBLs基因并测序；通过可变数目串联重复序列(VNTR)进行同源性分析。结果用纸片扩散法检出具有ESBLs表型的19菌株，经琼脂稀释法检测，同样具有ESBLs表型。菌株对头孢曲松、头孢噻肟、头孢哌酮、哌拉西林、阿莫西林-克拉维酸和环丙沙星的不敏感率为95%～100%，对其他药物敏感率均在84%以上。其型别主要为CTX-M-14、CTX-M-3、CTX-M-57和TEM-1。 同源性分析19株福氏志贺菌分为4个克隆系。结论唐山地区儿童福氏志贺菌呈多重耐药，对第3代头孢菌素耐药性有增加趋势，所携带基因型主要为CTX-M-14，首次检出CTX-M-57基因型。唐山地区存在遗传紧密相关的福氏志贺菌流行克隆，也存在不相关克隆。

福氏志贺菌；超广谱β内酰胺酶；基因型；VNTR；同源性

志贺菌属是导致儿童急性腹泻的重要原因。抗菌药物的使用导致了多重耐药(multi-drug resistance,MDR)的志贺菌属菌的产生，给临床治疗提出了新的挑战。由于志贺菌具有多种血清型和亚型，且耐药性越来越严重[1-2]，而产超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum beta-lactamases,ESBLs)是导致志贺菌耐药的主要原因，近年来，TEM、SHV、CTX-M、TOHO和PER型ESBLs在志贺菌属菌中均有报道。为探讨志贺菌的耐药机制和流行趋势，本研究对唐山妇幼保健院分离自儿童腹泻患者的福氏志贺菌中的ESBLs进行了研究，通过可变数目串联重复序列(variable number of tandem repeat,VNTR)进行同源性分析，来判断菌株间是否存在克隆株，以控制爆发流行。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

收集2007年4月至11月唐山妇幼保健院分离的产ESBLs的福氏志贺菌19株。均为急性痢疾患儿的粪便标本(经患儿家属同意)。药敏试验质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853。

1.2 ESBLs检测

参照CLSI推荐的纸片确证法检测菌株是否产ESBLs，如果菌株对头孢他定(30 μg)或头孢噻肟(30 μg)的抑菌圈直径比其加入克拉维酸(10 μg)后的抑菌圈直径≥5 mm，则认为菌株产ESBLs。对产ESBLs的菌株进一步用微量肉汤稀释法测定其MICs，菌株对头孢他定或头孢噻肟的MICs比其加入克拉维酸后MICs≥8倍，即菌株表达ESBLs。所有结果按CLSI M100-S18(2008)判定。分为敏感(S)、中介(I)和耐药(R)。

1.3 PCR扩增ESBLs基因并测序

对于所有经表型检测产ESBLs的菌株，PCR扩增TEM、TEM、SHV、CTX-M、PER和OXA型酶的基因并测序，引物见表1。

1.4 VNTR分型

对19株产ESBLs的菌株进行VNTR同源性分析，引物序列见表2。

表1 PCR引物及反应条件Table 1 PCR primer and reaction condition

表2 VNTR引物Table 2 VNTR primer

2 结果

2.1 菌株药敏结果及ESBLs检测

19株菌均具有ESBLs表型。其药物敏感性见

表3，菌株对头孢曲松、头孢噻肟、头孢哌酮、哌拉西林、阿莫西林-克拉维酸和环丙沙星的不敏感率为95%～100%，对其他药物敏感率均在84%以上。

2.2 ESBLs基因检测

19株具有ESBLs表型的福氏志贺菌中有17株表达CTX-M-14，1株表达CTX-M-57，1株表达CTX-M-3。1株blaTEM基因扩增阳性，经测序为TEM-1型广谱β-内酰胺酶，该菌株同时表达CTX-M-14图1。其他酶型扩增均为阴性。

表3 19株产ESBLs的福氏志贺菌抗菌药物敏感性Table 3 Drug susceptibility result of 19 producing ESBLs strains of Shigella flexneri

-.No recommend to fold point in the CLSI.

No2/No.16 CTX-M-1 gene is identified as CTX-M-3,CTX-M-57 after amplification; other CTX-M-9 gene isidefied as CTX-M-14 after ampilification; No.14 gene is identified as CTX-M-14 and TEM

图119株福氏志贺菌ESBLs基因PCR扩增电泳图谱
Fig1PCRamplificationelectrophoresispatternofESBLsgenotypesin19Shigellaflexneriisolates

图2 19株福氏志贺菌VNTR电泳图谱Fig 2 VNTR amplification electrophoresis pattern of ESBLs genotypes in 19 Shigella flexneri isolates

2.3 VNTR分型分析

19株福氏志贺菌的VNTR指纹图见图2。根据片段大小可分为A、B、C及D 4个克隆组，A组1、4、6、11、12和14为同一克隆；B组2、5、7、10和15为同一克隆；C组3、9、13、16和18为同一克隆；D组8、17和19为同一克隆。

3 讨论

福氏志贺菌是唐山妇幼保健院分离自儿童腹泻患者大便标本的主要致病菌，本研究所收集的19株产ESBLs的福氏志贺菌，均以水解头孢噻肟CTX-M型酶为主，而对头孢他定非常敏感。中国肠杆菌科菌所产ESBLs以CTX-M型酶为主，其中又以CTX-M-3、CTX-M-9、CTX-M-14为主[7]。已有报道在中国的福氏志贺菌中检出了CTX-M-14型ESBL，该研究中菌株也对头孢噻肟耐药而对头孢他定敏感，且经结合实验证明，其耐药性可经质粒水平传播[10]。

本研究所收集的19株产ESBLs的菌株，所分离患者均为儿科病房1～8岁患者，分离时间为患者住院后4～13 d，因此菌株所携带CTX-M-14型ESBLs很有可能来自其他产CTX-M-14的肠杆菌科菌。近年来不断在志贺菌中检出新的基因型，如已检出 CTX-M-3型[4，11]和CTX-M-55型[12]。本研究中首次在福氏志贺菌中分离出CTX-M-57型，这些酶均属CTX-M-1组。19株福氏志贺菌的VNTR指纹图根据片段大小可分为A、B、C及D 4个克隆组，A组1、4、6、11、12和14为同一克隆；B组2、5、7、10和15为同一克隆；C组3、9、13、16和18为同一克隆；D组8、17和19为同一克隆，说明菌株存在一定的亲缘性，存在遗传紧密相关的福氏志贺菌流行克隆，也存在不相关克隆。防控不当及易引起小范围暴发流行。

ESBLs的出现，给志贺菌感染的治疗和防控带来了压力，应加强其耐药性监测，以指导临床医生规范使用抗生素。通过对菌株同源性的检测，对预防和控制菌痢的流行具有十分重要的意义。

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据英国《BBC新闻》(BBC NEWS)(2012-08-03)报道，科学家表示，已研发出革新的“皮肤喷雾”来治疗下肢静脉溃疡。这种常见疾病病症包括在脚踝、下肢有浅层开放性顽固伤口。

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澳洲果蝠为破解致命病毒提供希望

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人类感染立百病毒的死亡率为40%～75%，亨德拉病毒一般是马受到感染，人类感染的死亡率则是50%以上。

这个新发现的Cedar病毒有90%基因与亨德拉病毒及立百病毒相同，但当研究人员将Cedar病毒注射至老鼠、天竺鼠以及雪貂身上时，未产生任何疾病。

研究主笔、澳洲联邦科学与工业研究组织澳洲动物卫生实验室(CSIRO’s Australian Animal Health Laboratory)的克雷马利(Gary Crameri)说，研究人员正在比较这3种病毒的DNA，以期找出造成立百病毒与亨德拉病毒致命的基因，进而找出治疗方法。

亨德拉病毒造成的马匹死亡率高达75%，尽管传染人体的情形罕见，不过在澳洲1994年以来记录有案的7起人体病例中，就有4人死亡。

研究刊登在《公共科学图书馆病原体》(PloS Pathogens)期刊上。

Extended-spectrum β-lactamases genotypes and homologous analysis ofShigellaflexneriisolates in Tangshan

GAO Chun-yan*, GAO Qing-shuang, LIU Shu-ping, XU Lin-ji, WANG Jing-jing, ZHENG Jian-xia

(Dept. of Clinical Laboratory,Tangshan Municipal Maternal and Child Care Hospital, Tangshan 063000, China)

ObjectiveTo analyze the resistant spectrum and the extended-spectrum β-lactamase genotypes of clinical isolates and homologous analysis ofShigellaflexneriin Tangshan.MethodsSensitivity testing was perfomed by K-B disk diffusion method ESBLs confirmation experiment. The MICs against ESBLs-producting were determined by trace broth dilution method.PCR method was employed to detect the genotypes of ESBLs producing strains. The PCR products were analyzed by DNA sequencing. Through the variable number tandem repeats (VNTR) homology analysis.ResultsESBLs were idenitified in 44.2%(19/43) ofShigellaflexneriisolates. So did MICs. 95～100% of these isolates were susceptible to ceftriaxone, cefotaxime, cefoperazone, piperacillin, amoxicillin-clavulanate.More than 84% these isolates were susceptible to other antibiotics. The genotypes of these stains included CTX-M-14, CTX-M-3、CTX-M-57 and TEM-1. Homology analysis 19 strains of shigella’s blessing is divided into four clones.ConclusionsShigellaflexneriisolates in Tangshan were multi-drug resistant with it is increased resistance to third generation cephalosporin. The main genotypes of ESBLs wasCTX-M-14. The first detectedCTX-M-57 genotype.Both genetic-related clones and non-related clones ofShigellaflexneriin Tangshan.

Shigellaflexneri； extended-spectrum β-lactamase；genotype；VNTR；homology

2013-06-25

2013-10-09

2012年河北省第十七批科学技术研究与发展计划项目(12277715)

*通信作者(correspondingauthor)： gcy3726694@aliyun.com

1001-6325(2014)02-0196-05

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