贾宏昉，陈红丽，黄化刚，杨永霞，崔红，刘国顺

1河南农业大学烟草学院、国家烟草栽培生理生化基地，河南省郑州市文化路95号 450002；2 贵州省烟草公司毕节市公司，贵州省毕节市天河路116号 551700

施用腐熟秸秆肥对烤烟成熟期碳代谢途径影响的初报

贾宏昉1，陈红丽1，黄化刚2，杨永霞1，崔红1，刘国顺1

1河南农业大学烟草学院、国家烟草栽培生理生化基地，河南省郑州市文化路95号 450002；2 贵州省烟草公司毕节市公司，贵州省毕节市天河路116号 551700

为了探明土壤添加腐熟秸秆对成熟期烤烟中部烟叶淀粉代谢途径的影响，明确获取优质烟叶的最佳施用量。本试验以烤烟品种NC89为试材，设置添加腐熟秸秆0 g/盆、80 g/盆和160 g/盆3个处理，研究不同量腐熟秸秆对成熟期烤烟淀粉积累、碳代谢相关酶活及关键基因表达的影响。结果表明：在烤烟发育成熟期，土壤添加不同量腐熟秸秆对中部叶还原糖、总糖及淀粉含量影响显著。土壤添加腐熟秸秆均可提高淀粉酶的活性，但是对转化酶影响不大；对碳代谢关键基因的表达分析表明添加腐熟秸秆增加了蔗糖合成酶基因（SS）、蔗糖转运蛋白基因（SUT1）、焦磷酸化酶基因（AGPase）和颗粒结合型淀粉合成酶基因（GBSSI）等关键基因的表达，从而促进成熟期烟叶碳代谢途径的进行，有利于提高烟叶的品质；其中每盆添加80 g腐熟秸秆取得的效果最好。

烟草；腐熟秸秆；碳代谢；成熟期

土壤的营养状态是影响植物生长发育的重要因子，对烤烟叶片淀粉的积累有显著影响。烤烟的品质与淀粉含量密切相关，烟草中淀粉的分解、转化、消耗和积累决定着烟叶内在品质和外观商品等级的优劣[1-2]。我国烟叶中淀粉含量约为4%～6%，远远高于国外优质烤烟的淀粉含量（1%～2%）[3]。淀粉含量高已经成为制约我国烟叶质量提高的一个重要因素。碳代谢途径是淀粉积累分解的重要环节，探讨烤烟淀粉积累及其组分的变化机理对改善烤烟品质具有重要价值。淀粉是碳代谢途径产物的重要形式，烤烟叶片中的碳代谢产物主要分为总糖、还原糖和淀粉，这三种物质的含量对烤烟品质的影响很大。与碳代谢密切相关的基因有蔗糖合成酶基因（SS）、蔗糖转运蛋白基因（SUT1）、蔗糖转化酶基因（INV）、焦磷酸化酶基因（AGPase）和颗粒结合型淀粉合成酶基因（GBSSI）等[4-6]。前人在水稻、小麦、大豆等作物上研究表明，叶片总糖、还原糖和淀粉含量与碳代谢相关酶或基因之间存在密切关系[4-6]。碳代谢相关基因或酶活对土壤营养条件是敏感型的[7-8]，可利用改善土壤营养条件进行有效的调控，以达到提高烟叶品质的目的。目前关于烟叶淀粉积累及相关碳代谢酶活及基因变化的研究很少，大多集中在生态环境方面，对土壤腐熟秸秆营养效应相关的机理研究还未见报道。本试验研究不同量腐熟秸秆对烤烟成熟期淀粉积累及相关基因表达的影响，旨在探索成熟期烟叶淀粉积累的机理，明确获取优质烟叶的合适腐熟秸秆添加量，为进一步调控烟叶淀粉积累、提高烟叶品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试烤烟品种为NC89，品种由北方烟草育种中心提供。

1.2 试验设计与处理

盆栽试验于2012年在河南农业大学科教园区进行，供试土壤为河南省许昌市许昌校区的耕作层土壤，土壤类型为黄褐土，质地为壤土；土壤有机质含量 12.10 g·kg-1，碱解氮含量 50.20 mg·kg-1，速效钾含量 130.70 mg·kg-1，速效磷含量 7.80 mg·kg-1，pH为8.05。

供试秸秆为人工发酵后的小麦秸秆，秸秆的人工发酵方法为：供试秸秆采自河南襄县2011年收获的小麦秸秆，采用人工切割成长度10 cm左右，人工调节秸秆含水量保持在60%～70 %，然后采取堆垛发酵，堆垛时采取一层秸秆（15 cm）+ 3 cm的土+经过处理的腐熟剂（腐熟剂与土混匀，增加腐熟剂的均匀度），堆垛高度为120 cm，发酵过程中每隔10天进行1次翻垛处理。当秸秆颜色变黑，同时用手一拉，成拉丝状断裂时，为完全腐熟状态。腐熟剂为鹤壁恒隆态生物科技有限公司生产的HM高效腐熟剂。发酵时间从2012年3月5日开始，4月15日发酵结束。腐熟后小麦秸秆全碳含量为19.48 %，全氮含量为0.598 %，C/N为32.6。

试验用盆规格为45×50 cm（直径×深度），试验设3个秸秆用量水平CK（0 g/盆）、T1（80 g/盆）和T2（160 g/盆），其中T1折算大田试验秸秆用量300 kg/亩，T2折算大田试验秸秆用量600 kg/亩。秸秆称重前采用鼓风干燥箱在40 ℃条件烘干3 h，相对含水量4.5 %。盆栽用土经自然风干后过0.5 cm×1 cm网筛备用，每盆装土20 kg。在移栽前一周将秸秆、土壤和肥料混匀后装盆，均匀浇水至土壤相对含水率在90%左右。每个处理30盆，随机排列，共计90盆。试验于2012年5月5日移栽，纯氮用量3 g·pot-1，N:P2O5:K2O=1:1.5:3。

1.3 样品采集

采集中部叶（10～12叶位），移栽后60 d取第1次样品，此时烟叶处于旺长后期，第1次取样后第2天安排打顶，即移栽后61 d开始打顶，随后在移栽后75 d和90 d各取1次样品，整个试验过程共取样3次，其中移栽后90 d时中部烟叶已到成熟采收期。选择5株长势一致的烟株，每株取1片烟叶，混合取样。每个时期3个重复。迅速置于液氮中，于-80℃冰箱冻存，用于基因表达研究和酶活分析；同时取组织样品，用于烟叶细胞超微结构分析。烤后样还原糖、总糖和淀粉含量的测定选取密集烤房三段式烘烤工艺烘烤后的C3F作为测试样品。

1.4 试验方法

1.4.1 淀粉粒观察[9]

选取生长发育良好的中部叶1 mm～3 mm，采用5 %戊二醛溶液固定，于冰箱内4℃保存。采用透射电镜观察淀粉粒超微结构，并拍照。

1.4.2 酶活性测定

将0.2 g叶片放入8 mL 1%的NaCl中研磨为匀浆后 3000 r/min 离心10 min，参照 Xue 等[10]的方法测定转化酶活性；参照 Doehlert 等[11]的方法等测定淀粉酶活性。

1.4.3 还原糖、总糖和淀粉含量测定[12]

取新鲜烟叶，去主脉，在105 ℃烘箱中烘烤15 min，60℃下烘烤2～3 h至烟叶到恒重。采用德国seal AA流动分析仪测定含量；其中还原糖和总糖为烤后样。

1.4.4 基因表达分析

选取生长发育良好的中部叶，每次取样将来源于不同烟株的5片叶混合以减少试验误差，所取叶片迅速置于液氮中冷冻保存。采用Trizol法提取烟草总RNA,样品通过随机引物法反转录合成cDNA。根据Genbank发布的蔗糖合成酶基因（SS）、蔗糖转运蛋白基因（SUT1）、蔗糖转化酶基因（INV）、焦磷酸化酶基因（AGPase）、颗粒结合型淀粉合成酶基因（GBSSI）和内参基因（L25）的序列设计各基因扩增引物，进行RT-PCR。

表1 烟草碳代谢途径关键基因RT-PCR引物序列Tab. 1 RT-PCR primer sequences of tobacco carbohydrate metabolism

1.5 数据处理

采用Sigmplot10.0和SPSS 12.0进行数据处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同量腐熟秸秆对移栽后90 d中部叶片细胞淀粉粒积累的影响

图1 移栽后90 d烟草中部叶片叶绿体内淀粉粒超微结构观察（×1000）Fig. 1 Ultrastructure of starch grains in chloroplast of middle leaf tobacco 90 days after transplanting

在烟株生长过程中，对中部叶位移栽后90 d的叶片取样，进行细胞超微观察，比较3个土壤状态下叶片采收时淀粉粒的积累和降解情况。结果如图1所示：由图1可以看出，3个处理中部叶片细胞均开始降解，淀粉粒颗粒数量多且体积大，分散在胞质中，形状、结构不规则；叶绿体被膜及叶绿体类囊体片层间分布有一些高电子密度嗜锇物质。3个处理相比，T1和T2处理相对于CK处理淀粉降解较充分，嗜锇颗粒数目明显较多。

2.2 不同量腐熟秸秆对成熟期烤烟中部叶碳代谢关键物质的影响

对添加不同量腐熟秸秆下叶片发育过程中的淀粉含量进行检测，结果见表2。成熟期烟叶淀粉含量处于上升趋势，在移栽后60 d 时T1和T2处理含量均显著高于对照CK，数据分析显示达到显著水平（P＜0.05）。移栽后60 d对照CK淀粉含量迅速增加，T1和T2处理增加相对缓慢，在移栽后75 d和90 d时两个处理均低于对照CK，烘烤后烟叶也低于对照，这可能与成熟期淀粉的降解有关。本研究对3个处理烤后样品进行分析，烤后样T1和T2处理淀粉含量仍显著低于对照（P＜0.05），但是总糖和还原糖却显著高于对照CK（P＜0.05），尤其是总糖比对照提高了12.98%～23.93 %。

表2 不同量腐熟秸秆处理中成熟期烤烟中部叶还原糖、总糖和淀粉的含量（杀青样和烤后样）Tab. 2 Content of reducing sugar, total sugar and starch in middle leaf tobacco under different application rates of rotten straw(samples after deactivation of enzymes and samples flue-cured)

2.3 不同量腐熟秸秆对成熟期烤烟中部叶碳代谢关键基因表达的影响

图2 不同量腐熟秸秆处理中成熟期烤烟中部叶碳代谢关键基因的表达分析Fig. 2 Expression analysis of key genes in the carbohydrate metabolism of middle leaf tobacco under different application rates of rotten straw

为了检测不同量腐熟秸秆对成熟期烤烟中部叶碳代谢关键基因表达的影响，本试验利用RT-PC技术对蔗糖合酶基因（SS）、蔗糖转运蛋白基因（SUT1）、转化酶基因（INV）、焦磷酸化酶基因（AGPase）和颗粒结合型淀粉合成酶基因（GBSSI）进行转录水平的表达分析，结果如图2所示。可以看出烟叶移栽后60 d到90 d这段时期碳代谢途径关键基因SS、SUT1、INV、AGPase和GBSS I均出现一个先增加后降低的趋势。对3个处理进行基因表达比较发现T1和T2处理碳代谢关键基因除转化酶基因（INV）外，其余基因表达均显著高于对照（CK），尤其是在烟叶移栽后75 d时T1处理GBSSI和AGPase基因表达显著高于T2和对照（CK）。这表明添加不同量腐熟秸秆可以增加成熟期烟叶的淀粉合成代谢能力。

2.4 不同量腐熟秸秆对成熟期烤烟中部叶碳代谢关键酶活性的影响

在烟叶成熟期中部叶片发育过程中，对碳代谢关键酶蔗糖转化酶和淀粉酶活性进行检测，结果如图3所示：由图3A可以看出淀粉酶活性变化在3个处理中均呈单峰曲线，整体趋势一致。随着叶片发育淀粉酶活性逐渐上升，在移栽后75 d时达到最大值，随后迅速降低。T1和T2处理淀粉酶活性在移栽后60 d时略低于对照（CK），而在移栽60 d以后显著高于对照（CK）。这表明T1和T2处理成熟期淀粉降解速度远远高于对照（CK）。由图3B可以看出转化酶活性在成熟期3个处理中均呈单峰曲线，但3个处理之间差异不显著，这和本研究检测的转化酶基因表达结果相一致（图2）。

图3 不同量腐熟秸秆处理中成熟期烤烟中部叶碳代谢关键酶的活性Fig. 3 Activity of key enzyme in carbohydrate metabolism of middle leaf tobacco under different application rates of rotten straw

3 讨论

植物碳水化合物的生物合成受到多因素的影响。大量的研究表明烟草叶片碳水化合物的含量也受到光照、温度 、干旱、海拔高度等生态环境因素的影响[13-15]。本研究对田间不同量腐熟秸秆下烟草植株成熟期中部叶蔗糖与淀粉合成相关基因的表达水平、酶活性、总糖含量、还原糖及淀粉含量进行研究分析。发现土壤添加腐熟秸秆有利于成熟期烟叶碳代谢途径的进行，降低了烤后烟叶的淀粉含量，增加了总糖和还原糖含量，对提高烟叶品质具有重要意义。

蔗糖是高等植物光合产物运输的主要形式, 经韧皮部运输到需要能源和碳源的组织细胞, 为细胞生长发育提供能源和碳源，在这个过程中蔗糖转运蛋白起关键作用。石永春等[16]研究表明，低温增加了烟草叶片SUT的表达量，有利于烟叶中蔗糖的积累。Burkle等[17]通过抑制烟草的 SUT表达而导致维管束中蔗糖含量降低，开花延迟。本研究表明通过土壤添加不同量腐熟秸秆可以增加蔗糖转运蛋白基因的表达，这预示着添加腐熟秸秆可能增强蔗糖转运蛋白的活性，从而有利于叶片尽量转运蔗糖，以满足各种代谢的需求，这和本试验检测到最终T1和T2处理烤烟中总糖和还原糖比对照显著增加相一致。

对植物体内淀粉合成代谢的研究表明，蔗糖合成酶（SS）和转化酶（INV）都具有催化蔗糖降解功能。蔗糖和淀粉的代谢紧密相关，SS主要调节蔗糖的降解，为淀粉合成提供底物，其活性的高低与淀粉积累量相一致[18]；而转化酶（INV）被认为是控制淀粉合成的关键酶[17]；另外，焦磷酸化酶（AGPase）为淀粉生物合成的限速酶，该酶活性的大小决定淀粉合成的速率和最终合成量的多寡[20-21]；因此，这3个基因的表达及酶活性大小意味着功能叶片中内含物积累的状况。本研究发现T1和T2处理均显著增加了蔗糖合成酶（SS）基因和焦磷酸化酶基因（AGPase）的表达活性，而转化酶基因（INV）表达变化差异不大，这和本试验测定的转化酶活性结果相一致，推测添加腐熟秸秆对成熟期叶片淀粉代谢途径的影响可能主要依赖于蔗糖合成酶（SS）和焦磷酸化酶（AGPase）；虽然T1和T2处理增加了淀粉合成的能力，但是由于这两个处理中淀粉酶活性也增强了，推测其分解淀粉的速度可能大于其合成速度，所以导致最终本研究检测到的叶片淀粉含量仍低于对照CK，这和细胞超微结构观察结果相一致。

另外，本研究对颗粒结合型淀粉合成酶基因（GBSSI）的表达进行了检测，表明T1处理的GBSSI基因表达量在成熟后期显著高于T2和CK，GBSSI作为颗粒结合型淀粉合成酶，紧密结合在淀粉粒上，通过 a-1,4-D-糖苷键将ADPG中的葡萄糖残基加到引物的非还原端，形成线性大分子[12]。GBSSI在T1处理烟叶中的活跃表达，说明T1处理烟叶中直链淀粉含量可能较高。但是直链淀粉含量的差异是否是T1处理成熟期烟叶淀粉含量显著低于对照CK的原因还需要进一步的验证。

4 结论

土壤添加腐熟秸秆有利于成熟期烟叶碳代谢，从而提高了烟叶的品质。至于土壤添加腐熟秸秆是通过增加土壤养分或通过改变土壤的物理和化学性状（土壤的pH、容重、持水特性等）来改变碳代谢相关基因和酶活的变化还需要进一步的深入研究来证实，这也是本研究下一步工作的重点。

[1]Gong C，Yuan H，Chen J，et a1．Studies on amylase and degradation of starch and pigment of tobacco leaf during process of flue-curing[J]．Agricultural Sciences in China，2004，12：931-936.

[2]Weeks W W. Chemistry of tobacco constituents influence flavor and aroma [J]．Recent Advance of Tobacco Science,1985, 11：175-200．

[3]宫长荣．烟草调制学[M]．北京：中国农业出版社，2003．

[4]Wang S Z, Cai Q S. Sucrose phosphate synthetase and sucrose synthetase activity to the different parts of tall fescue in low temperatures. Acta Agrestia Sinica, 2004,12(2): 129-149. (in Chinese)

[5]Chincinska I A, Liesche J, Krügel U, Michalska J,Geigenberger P, Grimm B, Kühn C. Sucrose transporter StSUT4 from potato affects flowering, tuberization, and shade avoidance response. Plant Physiology, 2008, 146:515-528.

[6]Nakamura Y．Carbohydrate metabolism in the developing endosperm of rice grains[J]．Plant Cell Physiol, 1989,30(1): 833-839.

[7]李彩凤，马凤呜，赵 越，等．氮素形态对甜菜氮糖代谢关键酶活性及相关产物的影响[J]. 作物学报， 2003，29(1): 128-132.

[8]崔丽娜，许珍，董树亭. 施钾对夏玉米子粒发育过程中糖代谢关键酶活性的影响[J]. 植物营养与肥料学报，2011，17(4): 869-880.

[9]朱法亮，徐兴阳，罗华元，等．植物透射电镜样品制备技术探讨[J]．中国野生植物资源，2006，25(3)：41-43．

[10]Xue G, McIntyre C L, Jenkins C L D, Glassop D,Herwaarden A F, Shorter S R. Molecular dissection of variation in carbohydrate metabolism related to watersoluble carbohydrate accumulation in stems of wheat. Plant Physiology, 2008, 146: 441-454.

[11]Doehlert DC, Duke SH. Specific determination of α-amylase activity in crude plant extracts containing β-amylase. Plant Physiology, 1983, 71: 229-234.

[12]张松涛，杨永霞，滑夏华，等．不同生态区烟叶淀粉生物合成动态比较研究[J]. 中国烟草学报，2012，18(4):31-34.

[13]史宏志，韩锦峰，远彤，等．红光和蓝光对烟叶生长、碳氮代谢和品质的影响[J]．作物学报，1999，2：215-220．

[14]黄国文，陈良碧．干旱对上部烟叶细胞结构和化学成分的影响[J]．生命科学研究，2004(2)：183-187．

[15]杨永霞，石冰瑾，王霄龙，等．不同海拔高度的烤烟淀粉合成动态研究[J]．湖南农业大学学报(自然科学版)，2012，38(1)：22-26.

[16]石永春，刘卫群，王小彦，等． 低温对烟草叶片中蔗糖向顶端分生组织转运的影响[J]. 中国农业科学，2009，42(12)：4390-4395.

[17]Burkle L, Hibberd J M, Quick W P, Kühn C, Hirner B,Frommer W B. The H-sucrose cotransporter NtSUT1 is essential for sugar export from tobacco leaves. Plant Physiology, 1998, 118: 59-68.

[18]谭彩霞，封超年，陈静，等．作物淀粉合成关键酶及其基因表达的研究进展[J]．麦类作物学报，2008，28(5)：912-919.

[19]Nakamura Y, Umemoto T, Takahata Y, Amano E.Characteristics and roles of key enzymes associated with starch biosynthesis in rice endosperm. Gamma Field Symposia, 1992, 31: 25-44.

[20]陈晓光，史春余，王振林，等．多效唑对食用甘薯北京553块根淀粉积累及相关酶活性的影响[J]. 中国农业科学，2012，45(1)：192-198.

[21]顾采琴，赖雅平，朱冬雪，等． 不同石灰化程度板栗中淀粉代谢及蔗糖含量变化[J]. 中国农业科学，2013，46(8)：1676-1681.

Preliminary report on effect of applying rotten straw fertilizer on carbon metabolism in maturing flue-cured tobacco

JIA Hongfang1, CHEN Hongli1, HUANG Huagang2, YANG Yongxia1, CUI Hong1，LIU Guoshun1
1 College of Tobacco Science, Henan Agricultural University; National Tobacco Cultivation, Physiology and Biochemistry Research Centre, Zhengzhou 450002, Henan, China；2 Bijie Municipal Tobacco Company, Bijie 551700, Guizhou, China

Tobacco variety NC 89 was sampled to investigate effect of applying rotten straw fertilizer on starch accumulation, enzymes activity of carbohydrate metabolism and expression of key genes in maturing flue-cured tobacco. Results showed that application of rotten straw fertilizer added in soil had significant impact on content of reducing sugar, total sugar and starch in middle tobacco leaves. It increased amylase activities while exerted little impact on invertase activities. It also increased expression level of starch biosynthesis-related genes and enzymatic activity ofSS, SUT1, AGPase, andGBSSI, thereby carbohydrate metabolism was facilitated.

tobacco; rotten straw fertilizer; carbohydrate metabolism

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.04.010

S572.06 文献标志码：A 文章编号：1004-5708（2014）04-0048-05

中国烟草总公司特色优质烟叶开发重大专项浓香型项目（110201101001 Ts-01）

贾宏昉（1982—），博士，讲师，主要从事植物营养分子遗传方面的研究，Email: jiahongfang@126.com

刘国顺（1954—），教授，博士生导师，主要从事烟草生理生化方面研究，Email: liugsh1851@163.com

2013-09-24