高英杰，赵红桃

(河北师范大学 生命科学学院，河北 石家庄 050024)

质粒DNA是一种基因运载工具，在分子生物学、基因工程中有着极为广泛的应用，作为质粒载体有3个共同的特征：一个复制子、一个选择性标志和一个克隆位点.而质粒 DNA 的分离提取是分子生物学实验中最基本的工作.现在已经建立了多种提取纯化质粒 DNA的方法[1]，这些方法都包括 3个步骤：培养细菌，收集和裂解细菌，纯化质粒DNA.由于质粒的大小不同，收集质粒的方法应有所区别，大于15 kb的质粒要用温和的方法.小于15 kb的质粒可以用较剧烈的方法，有些大肠杆菌例如：HB101不能用加热的方法裂解.分离纯化质粒的方法各有利弊，根据不同的实验要求对所提纯质粒的纯度也有所不同，通常提出的质粒都存在一定量的RNA和菌体染色体DNA的污染[2].纯化质粒DNA最经典的方法是氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心法[3]，溴化乙锭可以插入DNA碱基之间，溴化乙锭与线状DNA和闭环DNA结合有差别，在饱和溴化乙锭的氯化铯梯度溶液中线状DNA的浮密度为1.54 g/cm3，闭环DNA的浮密度为1.59 g/cm3，所以离心的结果是线状DNA和闭环DNA会停留在离心管的不同区域，从而将闭环DNA分离纯化出来.

氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心具体还可以分为连续梯度和不连续梯度.区别在于氯化铯溶液浓度在离心管中是否连续，如果是一个连续的浓度梯度，例如加入10 mg/mL溴化乙锭的终浓度1.55 g/mL的氯化铯溶液，经过超高速离心后会与 DNA、RNA等形成一个连续的浓度梯度，闭环 DNA会悬浮于某一层，从而可以收集纯化.不连续梯度是将3个不同浓度的氯化铯溶液逐一加至离心瓶中形成3种不同浓度氯化铯，这3种浓度的氯化铯并不混合，而是形成独立的三层进行离心.我们采用连续浓度梯度的方法对质粒 DNA进行分离，最终优化出了一套纯化方法，用氯化铯溴化乙锭连续密度梯度法可以得到理想的DNA，用于后续的实验.

1 仪器与方法

1.1 仪器

日立超速离心机，型号CP100WX，转头型号SRP83VT.

1.2 方法

1) 配制试剂：溶液I(50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L pH 8.0 Tris-Cl，10 mmol/L pH 8.0 EDTA)，溶液Ⅱ(0.2 mol/L NaOH, 1 g/L SDS)，溶液Ⅲ(294 g/L 醋酸钾, 115 mL/L冰醋酸)，EB溶液(10 mg/mL)，10 × SSC(1.5 mol/L NaCl, 0.15 mol/L柠檬酸钠).

2) 接菌到试管中，摇到混浊后扩培到1 L 2×YT培养基中，37 ℃ 摇培过夜；

3) 收集菌体，离心条件： 4 000 r/min，4 ℃，20 min，弃上清.加入25 mL溶液Ⅰ，振荡重悬菌体；

4) 加入50 mL 溶液Ⅱ并缓慢颠倒，冰上放置2 min；

5) 加入40 mL溶液Ⅲ颠倒混匀，冰上放置5～10 min；

6) 离心：4 000 r/min，25 ℃，20 min.(可用玻璃棒轻轻打碎大块的沉淀，以获得更好的离心效果).离心后将上清用折叠成漏斗状的miracloth(Millipore公司生产)过滤到新的250 mL离心瓶中(过滤白色不溶物，减少蛋白和基因组DNA污染)，加入等体积的异丙醇，在室温条件下沉淀15 min，静置后可以见到絮状沉淀；

7) 离心：12 000 r/min，4 ℃，10 min，弃去上清，沉淀用75 %乙醇洗2次，每次洗后均需离心3～5 min，离心后弃去上清；

8) 尽量吸干净上清，晾干沉淀，加入4 mL超纯水溶解，(可以用吹风机热风吹5 s即可)，加纯水后，若不易溶，可在37 ℃条件下促溶，由于质粒浓度大，溶解后比较粘稠有拉丝现象；

9) 将4 mL质粒溶液转移到15 mL离心管中，加入5.05 g氯化铯颠倒混匀，并使其充分溶解(氯化铯溶解过程中会吸热，溶液会变凉，溶解后会产生絮状物浮在液面，溶液为乳白色)；

10) 加入100 µL 100 mg/mL溴化乙锭(EB)溶液，混匀后离心：3 000 r/min，25 ℃，10 min，(液面上会有不溶物出现)；

11) 将上清转移到超速离心管中，(不建议使用移液器转移，因为会有很多气泡出现.可以改用注射器吸取并将上清转移).离心：65 000 r/min，25 ℃，16 h；

12) 离心结束后，离心管中会出现 3个明显的红色条带，最上一层为蛋白质，中间一层为缺口环状和线状DNA，最下一层条带为我们的目的条带闭环质粒DNA，将质粒约2～3 mL吸到15 mL离心管中(吸前先将超速离心管的顶部扎一小孔进气，方便后续吸取质粒层).然后加入10 × SSC平衡好的异戊醇，混匀，静置分层后将上层吸出弃去以便抽提溴化乙锭.

13) 重复上一步骤直到质粒溶液透明无色，将上层的异丙醇去除干净；

14) 将250 µL质粒溶液吸到2 mL离心管中，加4倍体积70 %乙醇，混匀后室温沉淀20 min；

15) 离心：1 200 r/min，25 ℃，10 min，弃上清，70 %乙醇洗涤沉淀；

16) 离心后将上清吸干，晾干沉淀，每管加入200 µL超纯水溶解.

2 结果与分析

由图1和图2可以看出，用氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心法提取的质粒DNA纯度明显高于普通的质粒小量抽提试剂盒所提取的质粒DNA，通过超微量紫外可见分光光度计测得质粒DNA质量浓度分别为500 ng/µL和 100 ng/µL.图 1电泳图所示氯化铯密度梯度离心获得的琼脂糖凝胶电泳亮度明显高于普通的质粒小量提取试剂盒得到的质粒的琼脂糖凝胶电泳.对于后续实验，我们对拟南芥原生质体进行双分子荧光互补实验，图 2所示用密度梯度离心法提取的质粒DNA可以达到60 %～70 %的转化率，而普通的质粒小量抽提试剂盒用于拟南芥转化最好只有10 %的转化效率.

图1 质粒电泳检测

图1A为用氯化铯密度梯度离心获得的不同构建的质粒的琼脂糖凝胶电泳.

图1B为用普通的质粒小量提取试剂盒得到的质粒的琼脂糖凝胶电泳.

图 1A一个融合 YFP的基因，通过氯化铯密度梯度离心获得的高纯度的质粒，用于拟南芥原生质体的转化，转化效率约为60 %～70 %，效率较高.

图1B为用普通的质粒小量提取试剂盒得到的质粒用于拟南芥原生质体转化，转化效率仅为10 %左右.

图2 质粒质量鉴定-原生质体转化

3 讨论

影响氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心法提取质粒DNA因素及应注意的事项如下：

1) 实验过程中用到氯化铯及溴化乙锭均为有毒试剂，必须戴手套，减少与皮肤直接接触.

2) 离心的次数较多，还需用到超速离心，一定要在专业人员培训后方可操作，以免发生事故.

3) 离心结束后，吸取质粒DNA时一定要注意，吸前先将超速离心管的顶部扎一小孔进气，方便后续吸取质粒层.

4) 对质粒DNA要及时进行抽提，过夜或长时间放置都会导致EB不容易抽提出来.

5) 异丙醇有刺激性气味，进行异丙醇去处操作时最好在通风橱中进行.

[1] 李亮,蔡志强,赵希岳.细菌质粒DNA的快速提取及检测[J].江苏工业学院学报,2003,15(3):30-31.

[2] 黄南,程熠,连欢,等.改进溶液 II配方可提高质粒 DNA 提取的质量及得率[J].华中科技大学学报:医学版,2008,37(6):816-818.

[3] J·萨姆布鲁克, D·W·拉塞尔.分子克隆实验指南:上[M].黄培堂,译.北京:科学出版社,2002:53-58.