胡选萍+陈志远

摘要：以耐寒柑橘（Critus reticulata Blanco）为试材，研究了培养基、消毒处理方式、外植体类型以及2，4-D与KT对柑橘愈伤组织诱导的影响，优化柑橘愈伤组织培养条件。结果表明，柑橘愈伤组织诱导中MT培养基的诱导效果优于MS培养基，统计学分析差异显著；带外种皮消毒处理方式更有利于外植体的脱分化，愈伤诱导率均在90%以上；胚与子叶外植体分别在f与i培养基上脱分化效果相对最佳，其诱导率为93.10%与93.33%；培养基中2，4-D浓度为2.0～3.0 mg/L适合柑橘愈伤组织的诱导，且激素KT与2，4-D之间具有良好的正向协同作用，当培养基中KT为0.5 mg/L时，诱导率增加25.75%，疏松愈伤率增加14.48%。

关键词：耐寒柑橘（Critus reticulata Blanco）；愈伤组织；诱导；优化

中图分类号：S666 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）18-4460-04

柑橘（Citrus reticulata Blanco）是世界四大水果之一，其国际贸易额位居世界第3，仅次于小麦和蔬菜[1，2]。柑橘隶属芸香科（Rutaceae）柑橘属（Citrus），其营养成分丰富，富含黄酮[3]，具有抗氧化、抗病毒、抗炎症、抗癌活性、预防动脉硬化等作用[4，5]。陕西省汉中市城固县作为陕南最大的柑橘生产基地，通过国家绿色食品发展中心认证的柑橘生产基地面积达到6 667 hm2，被国家林业部命名为“中国柑橘之乡”[6]。柑橘作为陕南重要的经济作物之一，在农业区域规划中被放在重点优先发展的地位。由于柑橘对低温比较敏感，而汉中地区处亚热带北缘，冬季低温和秋季多雨导致柑橘局部冻害一直是制约柑橘产业大发展的重要因素，因此提高柑橘的抗逆性对于柑橘产业可持续发展具有重要意义。近年来生物技术被广泛应用于柑橘抗性资源的研究与开发利用中，并取得了显著成果[7]。

本研究以耐寒柑橘为试材，研究了不同因子对柑橘愈伤组织诱导的效应方式与效应程度，为深入研究耐寒柑橘体细胞胚胎发生及抗寒机理提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料为陕西省汉中市城固县柑橘生产基地的早熟耐寒品种日南1号，外植体来源于成熟柑橘果实种子，经晾晒、去杂后，剥离出未受精败育种子胚与子叶作为研究试材。

试验用NAA、6-BA、2，4-D与KT均为分析纯；MS与MT培养基自配。

1.2 方法

1.2.1 外植体的预处理 选择饱满圆润、大小均一的柑橘种子浸泡8 h，用自来水冲洗掉表面的杂质，在流水下冲洗1～2 h，备用。在超净工作台将柑橘种子直接或剥离外种皮后用75%的乙醇表面消毒30 s，再用0.1%升汞（HgCl2）浸泡8～10 min，处理过程中不断摇动，然后用无菌水冲洗5～6次，每次2～3 min。在铺有滤纸的培养皿中分离出胚与子叶，胚直接接种，子叶切分为长宽约为0.5 cm的小块作为外植体。

1.2.2 培养基配制 分别以MS与MT为基本培养基，按3.0%的量加入蔗糖，按0.6%的量加入琼脂粉，添加以不同种类与浓度配比的生长调节因子，设计为16种组合配比（表1），调节pH为5.8～6.0，121 ℃灭菌20 min。

1.2.3 愈伤组织的诱导 无菌操作条件下，将柑橘种子胚接入a～i培养基，子叶接入Ⅰ～Ⅶ及a～i培养基中。在温度（25±2） ℃，相对湿度50%～60%的条件下，暗培养4周，观察愈伤的发生时间、颜色、质地及生长情况，统计体积明显膨大的外植体数与诱导出愈伤组织的外植体数，并依此计算出相应的二级变量。接种15 d后，去除污染与坏死材料，统计无菌外植体数（视为接种量），接种3周统计膨大的外植体数（视为膨大数），计算膨大率，膨大率=膨大数/接种量×100%。统计接种4周诱导出愈的外植体数（视为诱导数）与疏松愈伤组织的外植体数（视为疏松数），计算诱导率与疏松愈伤率，诱导率=诱导数/接种量×100%；疏松愈伤率=疏松数/诱导数×100%。

1.2.4 数据统计与分析 采用SPSS16.0统计分析软件对试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 培养基对耐寒柑橘愈伤组织诱导的影响

从表2中可以看出，对于MS与MT两种培养基体系而言，MT培养基的愈伤组织诱导效果明显优于MS培养基。MT培养基中愈伤组织发生时间提前1 d左右，且愈伤组织呈淡黄色，质地疏松，生长旺盛，品质好，后期褐变程度低。在MT培养基中（其中激素为2.0 mg/L 2，4-D），子叶外植体的膨大率（91.75%）与愈伤诱导率（87.61%）明显高于MS培养基，且两种不同处理间差异显著（P<0.05）。同样对于处理Ⅱ与处理Ⅵ（培养基中激素2.0 mg/L 2，4-D、0.5 mg/L KT）而言，处理Ⅵ的诱导率（94.31%）明显高于处理Ⅱ（86.58%），表现出相似的MT诱导优势。因此，对于耐寒柑橘子叶外植体而言，MT为相对合适的基本培养基质。

2.2 消毒处理方式对耐寒柑橘愈伤组织诱导的影响

采用两种不同外植体消毒处理方式：带外种皮消毒处理，即柑橘种子不用预先剥去外种皮，直接用75%乙醇表面消毒30 s后，再用0.1% HgCl2浸泡10 min；不带外种皮消毒处理，即先剥离外种皮，然后用75%乙醇与0.1% HgCl2配合消毒，乙醇处理同上，0.1% HgCl2处理8 min。试验表明在两种不同消毒处理方式下，柑橘子叶外植体脱分化与愈伤组织诱导形成存在明显差异（图1、图2）。

带外种皮消毒处理虽然子叶剥离略微困难，但外植体脱分化状态较好，外植体多呈淡绿色，在培养初期均出现明显膨大，5 d左右开始出现愈伤组织，且愈伤多呈现淡黄绿色，透明有光泽，且愈伤组织生长速度快，积累量较大。而不带外种皮消毒处理消毒处理方式，外植体培养2～3 d后颜色变白，膨大程度较低，愈伤组织出现时间也相对较晚，大约7～10 d后有淡黄色的愈伤组织形成，到第4周愈伤组织的诱导形成基本稳定，且愈伤积累量总体较少。从愈伤诱导效果来看，带外种皮消毒明显比不带外种皮消毒脱分化效果好（图1、图2），不带外种皮消毒处理柑橘子叶在Ⅰ～Ⅲ培养基上的诱导率为80%左右，而带外种皮消毒处理中外植体愈伤诱导率均在90%以上，甚至在处理Ⅱ可达到完全脱分化（诱导率100%），t检验表明，两种消毒处理方式的膨大率与诱导率均差异显著（P<0.05）。endprint

2.3 外植体类型对耐寒柑橘愈伤组织诱导的影响

分别将柑橘子叶和胚外植体接种于a～i培养基中，柑橘种子胚在第5天左右开始膨大，子叶则相对迟缓，外植体膨大时间略晚（2～3 d），10～14 d为膨大高峰期（图3、图4）。二者均在7 d左右在外植体表面出现少量颗粒状愈伤组织，15～20 d愈伤组织形成与积累达到相对高峰。胚作为外植体形成的愈伤组织多发生在外植体侧面或远培养基端，愈伤多成淡黄色或乳白色；子叶愈伤组织的多发生在外植体侧面与近培养基端居多，且愈伤多呈淡黄色。

对于胚而言，在f培养基上脱分化效果相对最佳（诱导率93.10%），而同样条件下子叶外植体脱分化效果处于较低水平（诱导率43.33%）；同样，对于子叶而言愈伤组织诱导效果最佳的激素组合配比为i培养基（诱导率93.33%），而此条件对胚（诱导率61.54%）并非最佳。由此可见，两种外植体对不同生长调节因子的敏感性存在较大差异，需要针对外植体的特点，选择适合该外植体愈伤组织诱导的恰当的激素种类与浓度配比条件。

2.4 激素对愈伤组织诱导的影响

2.4.1 2，4-D对愈伤组织诱导的影响 2，4-D对愈伤组织诱导的影响见表3。Ⅰ～Ⅲ培养基之间在膨大率与诱导率两个效应变量上差异显著。结果表明， 2，4-D是影响柑橘子叶外植体脱分化产生愈伤组织的重要因子。当2，4-D浓度为2.0 mg/L（处理Ⅱ）时诱导率为86.58%，显著高于处理Ⅰ（72.33%）（P<0.05），较高浓度2，4-D更有利于愈伤组织的发生；处理Ⅱ与处理Ⅲ之间差异不显著，2.0～3.0 mg/L 2，4-D是柑橘子叶愈伤组织诱导较为合适的浓度范围。2，4-D对柑橘愈伤组织的结构与质地没有明显的影响作用，Ⅰ～Ⅲ培养基之间疏松愈伤组织的诱导率差异不显著。

2.4.2 KT对愈伤组织诱导的影响 培养基中2，4-D浓度为2.0 mg/L水平， KT浓度对柑橘子叶愈伤组织诱导的影响见表4。培养基中添加KT可使愈伤组织的诱导率增加13.04%（KT为0.1 mg/L）与 25.75%（KT为0.5 mg/L），培养基中KT激素的添加对柑橘愈伤组织的诱导具有一定的促进作用。KT与2，4-D配合使用更加有利于外植体的脱分化，膨大率与诱导率效果显著性高于使用2，4-D（P<0.05）；且形成的愈伤组织中疏松愈伤组织占的比例相对较大，愈伤组织的积累量也较多。在柑橘愈伤组织诱导中KT与2，4-D之间具有良好的正向协同作用。

3 小结与讨论

愈伤组织的诱导发生受外植体类型、光照条件、植物基因型等诸多因素的影响，其中植物生长物质对植物离体培养中的细胞分化和形态建成具有明显的调节作用[8]，尤其是生长素类和细胞分裂素类的对于诱导原基的形成非常重要[9，10]。本试验以耐寒柑橘为试材，分析了培养基、消毒处理方式、外植体类型以及2，4-D与KT对柑橘愈伤组织诱导的效应。结果表明，MT培养基与MS培养基相比，更有利于耐寒柑橘愈伤组织的发生和愈伤组织的积累。MS培养基是普遍使用的植物组培培养基，其对固体培养条件下诱导愈伤组织效果明显。MT培养基不仅保留了MS培养基中高硝酸盐、钾和铵的特点，而且含有更为丰富的烟酸、维生素B6等有机物，能够满足快速增长的组织对营养元素的需求，是一种较适合柑橘愈伤组织诱导的培养基。

带外种皮消毒能够相对更好地保持柑橘种子胚与子叶细胞相对高活力状态，因此更有利于其脱分化与愈伤组织形成。柑橘种子胚与子叶在不同激素组合培养基中愈伤组织的诱导效果差异很大，其适合的激素组合浓度配比不同，这可能与外植体本身所含的外植体的种类、质量浓度水平差异和对外源激素的反应灵敏性不同有关[11]。在多数植物愈伤组织的诱导中，2，4-D是一个很有效的激素[12，13]，对柑橘而言，较高质量浓度的2，4-D同样有利于愈伤组织的发生，但2，4-D只影响柑橘愈伤组织的诱导率，而对愈伤组织的结构与品质没有显著影响。添加一定浓度的KT可以很大程度上增加了愈伤组织的诱导率，而且可以改变愈伤组织的结构与品质，更有利于疏松愈伤组织的形成与积累，这充分证明了KT与2，4-D在愈伤诱导方面的协同促进作用。

参考文献：

[1] LIU J H， XU X Y， DENG X X. Advances on citrus somatic hybrids and inheritance of their nuclear and cytoplasmic components[J]. Journal of Agricultural Biotechnology，2004，12（3）：237-246.

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[4] 彭 燕，盛雪飞，吴 丹，等.柑橘属中黄铜类化合物的研究与应用进展[J].食品与发酵工业，2009，35（7）：113-118.

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[6] 刘治才，敖义俊，王 侠，等.城固县柑橘产业发展成就及前景展望[J].浙江柑橘，2011，27（4）：2-5.

[7] 方治军，杨义伶，黄春辉，等.生物技术在柑橘砧木上的应用[J].中国农学通报，2010，26（10）：226-229.

[8]吕冬霞，曲长福.植物生长调节剂对愈伤组织培养的影响[J].北方园艺，2004（5）：68.

[9]朱青松，梅康凤，王沙生.外源生长素对烟草髓愈伤组织分化和内源IAA含量的影响[J].北京林业大学学报，1999，12（1）：22-25.

[10]熊国胜，李家洋，王永红.植物激素调控研究进展[J].科学通报，2009，54（18）：2718-2733.

[11]杨继涛，邹志荣，张素勤，等.植物激素对非洲菊花托愈伤组织诱导的研究[J].西北农业学报，2003，12（3）：133-135.

[12]申秋秀，胡根海，赵伟伟，等.不同浓度激素处理对棉花愈伤组织诱导的影响[J].种子，2009，28（7）：101-104.

[13]张彩侠，曹 彬，史 梅.不同激素对大叶黄杨幼茎愈伤组织的诱导试验[J].贵州农业科学，2009，37（8）：25-27.endprint

2.3 外植体类型对耐寒柑橘愈伤组织诱导的影响

分别将柑橘子叶和胚外植体接种于a～i培养基中，柑橘种子胚在第5天左右开始膨大，子叶则相对迟缓，外植体膨大时间略晚（2～3 d），10～14 d为膨大高峰期（图3、图4）。二者均在7 d左右在外植体表面出现少量颗粒状愈伤组织，15～20 d愈伤组织形成与积累达到相对高峰。胚作为外植体形成的愈伤组织多发生在外植体侧面或远培养基端，愈伤多成淡黄色或乳白色；子叶愈伤组织的多发生在外植体侧面与近培养基端居多，且愈伤多呈淡黄色。

对于胚而言，在f培养基上脱分化效果相对最佳（诱导率93.10%），而同样条件下子叶外植体脱分化效果处于较低水平（诱导率43.33%）；同样，对于子叶而言愈伤组织诱导效果最佳的激素组合配比为i培养基（诱导率93.33%），而此条件对胚（诱导率61.54%）并非最佳。由此可见，两种外植体对不同生长调节因子的敏感性存在较大差异，需要针对外植体的特点，选择适合该外植体愈伤组织诱导的恰当的激素种类与浓度配比条件。

2.4 激素对愈伤组织诱导的影响

2.4.1 2，4-D对愈伤组织诱导的影响 2，4-D对愈伤组织诱导的影响见表3。Ⅰ～Ⅲ培养基之间在膨大率与诱导率两个效应变量上差异显著。结果表明， 2，4-D是影响柑橘子叶外植体脱分化产生愈伤组织的重要因子。当2，4-D浓度为2.0 mg/L（处理Ⅱ）时诱导率为86.58%，显著高于处理Ⅰ（72.33%）（P<0.05），较高浓度2，4-D更有利于愈伤组织的发生；处理Ⅱ与处理Ⅲ之间差异不显著，2.0～3.0 mg/L 2，4-D是柑橘子叶愈伤组织诱导较为合适的浓度范围。2，4-D对柑橘愈伤组织的结构与质地没有明显的影响作用，Ⅰ～Ⅲ培养基之间疏松愈伤组织的诱导率差异不显著。

2.4.2 KT对愈伤组织诱导的影响 培养基中2，4-D浓度为2.0 mg/L水平， KT浓度对柑橘子叶愈伤组织诱导的影响见表4。培养基中添加KT可使愈伤组织的诱导率增加13.04%（KT为0.1 mg/L）与 25.75%（KT为0.5 mg/L），培养基中KT激素的添加对柑橘愈伤组织的诱导具有一定的促进作用。KT与2，4-D配合使用更加有利于外植体的脱分化，膨大率与诱导率效果显著性高于使用2，4-D（P<0.05）；且形成的愈伤组织中疏松愈伤组织占的比例相对较大，愈伤组织的积累量也较多。在柑橘愈伤组织诱导中KT与2，4-D之间具有良好的正向协同作用。

3 小结与讨论

愈伤组织的诱导发生受外植体类型、光照条件、植物基因型等诸多因素的影响，其中植物生长物质对植物离体培养中的细胞分化和形态建成具有明显的调节作用[8]，尤其是生长素类和细胞分裂素类的对于诱导原基的形成非常重要[9，10]。本试验以耐寒柑橘为试材，分析了培养基、消毒处理方式、外植体类型以及2，4-D与KT对柑橘愈伤组织诱导的效应。结果表明，MT培养基与MS培养基相比，更有利于耐寒柑橘愈伤组织的发生和愈伤组织的积累。MS培养基是普遍使用的植物组培培养基，其对固体培养条件下诱导愈伤组织效果明显。MT培养基不仅保留了MS培养基中高硝酸盐、钾和铵的特点，而且含有更为丰富的烟酸、维生素B6等有机物，能够满足快速增长的组织对营养元素的需求，是一种较适合柑橘愈伤组织诱导的培养基。

带外种皮消毒能够相对更好地保持柑橘种子胚与子叶细胞相对高活力状态，因此更有利于其脱分化与愈伤组织形成。柑橘种子胚与子叶在不同激素组合培养基中愈伤组织的诱导效果差异很大，其适合的激素组合浓度配比不同，这可能与外植体本身所含的外植体的种类、质量浓度水平差异和对外源激素的反应灵敏性不同有关[11]。在多数植物愈伤组织的诱导中，2，4-D是一个很有效的激素[12，13]，对柑橘而言，较高质量浓度的2，4-D同样有利于愈伤组织的发生，但2，4-D只影响柑橘愈伤组织的诱导率，而对愈伤组织的结构与品质没有显著影响。添加一定浓度的KT可以很大程度上增加了愈伤组织的诱导率，而且可以改变愈伤组织的结构与品质，更有利于疏松愈伤组织的形成与积累，这充分证明了KT与2，4-D在愈伤诱导方面的协同促进作用。

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[12]申秋秀，胡根海，赵伟伟，等.不同浓度激素处理对棉花愈伤组织诱导的影响[J].种子，2009，28（7）：101-104.

[13]张彩侠，曹 彬，史 梅.不同激素对大叶黄杨幼茎愈伤组织的诱导试验[J].贵州农业科学，2009，37（8）：25-27.endprint

2.3 外植体类型对耐寒柑橘愈伤组织诱导的影响

分别将柑橘子叶和胚外植体接种于a～i培养基中，柑橘种子胚在第5天左右开始膨大，子叶则相对迟缓，外植体膨大时间略晚（2～3 d），10～14 d为膨大高峰期（图3、图4）。二者均在7 d左右在外植体表面出现少量颗粒状愈伤组织，15～20 d愈伤组织形成与积累达到相对高峰。胚作为外植体形成的愈伤组织多发生在外植体侧面或远培养基端，愈伤多成淡黄色或乳白色；子叶愈伤组织的多发生在外植体侧面与近培养基端居多，且愈伤多呈淡黄色。

对于胚而言，在f培养基上脱分化效果相对最佳（诱导率93.10%），而同样条件下子叶外植体脱分化效果处于较低水平（诱导率43.33%）；同样，对于子叶而言愈伤组织诱导效果最佳的激素组合配比为i培养基（诱导率93.33%），而此条件对胚（诱导率61.54%）并非最佳。由此可见，两种外植体对不同生长调节因子的敏感性存在较大差异，需要针对外植体的特点，选择适合该外植体愈伤组织诱导的恰当的激素种类与浓度配比条件。

2.4 激素对愈伤组织诱导的影响

2.4.1 2，4-D对愈伤组织诱导的影响 2，4-D对愈伤组织诱导的影响见表3。Ⅰ～Ⅲ培养基之间在膨大率与诱导率两个效应变量上差异显著。结果表明， 2，4-D是影响柑橘子叶外植体脱分化产生愈伤组织的重要因子。当2，4-D浓度为2.0 mg/L（处理Ⅱ）时诱导率为86.58%，显著高于处理Ⅰ（72.33%）（P<0.05），较高浓度2，4-D更有利于愈伤组织的发生；处理Ⅱ与处理Ⅲ之间差异不显著，2.0～3.0 mg/L 2，4-D是柑橘子叶愈伤组织诱导较为合适的浓度范围。2，4-D对柑橘愈伤组织的结构与质地没有明显的影响作用，Ⅰ～Ⅲ培养基之间疏松愈伤组织的诱导率差异不显著。

2.4.2 KT对愈伤组织诱导的影响 培养基中2，4-D浓度为2.0 mg/L水平， KT浓度对柑橘子叶愈伤组织诱导的影响见表4。培养基中添加KT可使愈伤组织的诱导率增加13.04%（KT为0.1 mg/L）与 25.75%（KT为0.5 mg/L），培养基中KT激素的添加对柑橘愈伤组织的诱导具有一定的促进作用。KT与2，4-D配合使用更加有利于外植体的脱分化，膨大率与诱导率效果显著性高于使用2，4-D（P<0.05）；且形成的愈伤组织中疏松愈伤组织占的比例相对较大，愈伤组织的积累量也较多。在柑橘愈伤组织诱导中KT与2，4-D之间具有良好的正向协同作用。

3 小结与讨论

愈伤组织的诱导发生受外植体类型、光照条件、植物基因型等诸多因素的影响，其中植物生长物质对植物离体培养中的细胞分化和形态建成具有明显的调节作用[8]，尤其是生长素类和细胞分裂素类的对于诱导原基的形成非常重要[9，10]。本试验以耐寒柑橘为试材，分析了培养基、消毒处理方式、外植体类型以及2，4-D与KT对柑橘愈伤组织诱导的效应。结果表明，MT培养基与MS培养基相比，更有利于耐寒柑橘愈伤组织的发生和愈伤组织的积累。MS培养基是普遍使用的植物组培培养基，其对固体培养条件下诱导愈伤组织效果明显。MT培养基不仅保留了MS培养基中高硝酸盐、钾和铵的特点，而且含有更为丰富的烟酸、维生素B6等有机物，能够满足快速增长的组织对营养元素的需求，是一种较适合柑橘愈伤组织诱导的培养基。

带外种皮消毒能够相对更好地保持柑橘种子胚与子叶细胞相对高活力状态，因此更有利于其脱分化与愈伤组织形成。柑橘种子胚与子叶在不同激素组合培养基中愈伤组织的诱导效果差异很大，其适合的激素组合浓度配比不同，这可能与外植体本身所含的外植体的种类、质量浓度水平差异和对外源激素的反应灵敏性不同有关[11]。在多数植物愈伤组织的诱导中，2，4-D是一个很有效的激素[12，13]，对柑橘而言，较高质量浓度的2，4-D同样有利于愈伤组织的发生，但2，4-D只影响柑橘愈伤组织的诱导率，而对愈伤组织的结构与品质没有显著影响。添加一定浓度的KT可以很大程度上增加了愈伤组织的诱导率，而且可以改变愈伤组织的结构与品质，更有利于疏松愈伤组织的形成与积累，这充分证明了KT与2，4-D在愈伤诱导方面的协同促进作用。

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