副溶血性弧菌保藏条件研究

2014-11-20杨胜远韦锦李卓文等

湖北农业科学 2014年18期

杨胜远+韦锦+李卓文等

摘要：针对副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）在低温条件下容易进入不可培养状态，难以保藏的问题，通过平板菌落计数法对副溶血性弧菌的4 ℃冰箱保藏条件进行了探讨。结果表明，NaCl对副溶血性弧菌4 ℃保藏有保护作用，其中以45 g/L NaCl保护效果最佳，而且45 g/L NaCl不影响副溶血性弧菌的生长。将副溶血性弧菌细胞浸于45 g/L NaCl溶液或以含45 g/L NaCl的培养基培养后直接于4 ℃保藏，保藏90 d，活细胞数仅由109下降到106。

关键词：副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）；甘油；培养基；NaCl

中图分类号：TS207.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）18-4395-04

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种嗜盐性细菌，广泛存在于世界各国的沿海地区，隶属于弧菌科弧菌属，是食源性疾病的重要病原菌，副溶血性弧菌引起的食物中毒已高居微生物食物中毒的首位[1，2]。为了控制副溶血性弧菌引起的食源性疾病，国内外学者已对副溶血性弧菌的检测、预测模型及风险评估、群体感应、防控方法、致病机理等领域研究给予了极大关注[3–11]。然而，由于副溶血性弧菌在低温条件下很容易进入不可培养状态[12，13]，采用常规的斜面或半固体培养基在4 ℃冰箱保藏的时间很短，通常4 ℃保藏15～30 d已无法通过国家标准GB/T 4789.7–2013的3%氯化钠碱性蛋白胨水培养基[14]或TCBS琼脂培养基活化。一些研究或检验机构为了保藏副溶血性弧菌标准菌株，常采用室温保藏或-80 ℃冷冻保藏。

虽然室温保藏成本低，但是需要经常转接活化，不断传代容易发生菌种变异，难以满足菌种保藏“在一定时间内使菌种不死、不变、不乱”的基本要求；副溶血性弧菌是病原菌，需要执行双人双锁管理，频繁的转接菌种和培养操作，增加了菌种保藏和安全防护的工作量。-80 ℃冷冻保藏可以抑制副溶血性弧菌的代谢，菌种不易发生变异，但是超低温冰箱价格贵，能耗高，普通实验室无法满足保藏条件，而且菌种使用前需解冻，使用不便，反复冻融操作还会导致菌种死亡。普通冰箱价格相对便宜，一般实验室均具备，因此如能解决副溶血性弧菌在低温条件下易进入不可培养状态的问题，实现4 ℃冰箱保藏将对相关的研究和检验工作具有极大的推动作用。本研究旨在对副溶血性弧菌的4 ℃冰箱保藏条件进行研究，探寻一种方便的副溶血性弧菌短期保藏方法。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株：副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）CP1由广东海洋大学孙力军教授惠赠。

试剂：TCBS琼脂培养基，青岛海博生物技术有限公司生产；其他试剂均为市售国产生化试剂或分析纯试剂。

仪器：LRH-250型恒温培养箱，上海-恒科学仪器有限公司；HZQ-X100型恒温双层振荡培养箱，太仓市实验设备厂；VX-200型漩涡混合仪，美国Labnet公司。

培养基：30 g/L氯化钠碱性蛋白胨水琼脂培养基（Alkaline Peptone Water Agar， APWA）及30 g/L氯化钠碱性蛋白胨水（Alkaline Peptone Water， APW）参照文献[14]进行配制，其中APWA培养基的琼脂用量改为10 g/L，APW培养基只对氯化钠浓度进行相应调整。

1.2 试验方法

1.2.1 副溶血性弧菌的培养从副溶血性弧菌斜面挑取1环菌苔接入装有100 mL 30 g/L NaCl-APW 培养基的250 mL三角瓶，于37 ℃、120 r/min摇床培养12 h，作为种子液和保藏所需的培养液。

1.2.2 副溶血性弧菌计数取待测样品1 mL加入9 mL NaCl溶液（30 g/L）中，旋涡混匀，记为10-1；取10-1稀释液1 mL加入9 mL NaCl溶液（30 g/L）中，旋涡混匀，记为10-2；如此依次进行10倍梯度稀释至10-8。分别取适宜稀释度的稀释液1 mL于无菌培养皿中，倾注冷却到50 ℃左右的30 g/L NaCl-APWA培养基15 mL，混匀、静置凝固，于37 ℃倒置培养18 h，进行菌落计数。每个稀释度重复3块平板，取平均值作为该稀释度的菌落总数。

1.2.3 不同保护剂对副溶血性弧菌保藏的影响将副溶血性弧菌培养液分别与无菌水、无菌30 g/L NaCl溶液、无菌40 g/L甘油水溶液、无菌30 g/L NaCl-40 g/L甘油复合溶液按体积比1∶1进行混合，再用漩涡混合仪充分混匀，然后分装2 mL无菌Eppendorf离心管，加盖密闭作为保藏管。分为3组，分别置于25、4 、-20 ℃下保藏，定时取样测定副溶血性弧菌数。

1.2.4 NaCl浓度对副溶血性弧菌保藏的影响将副溶血性弧菌培养液分别与10、20、30、40、50、60、70 g/L的无菌NaCl溶液按体积比1∶1进行混合并用漩涡混合仪充分混匀，然后分装2 mL无菌Eppendorf离心管，加盖密闭作为保藏管，置于4 ℃保藏，定时取样测定副溶血性弧菌数。均设3个平行试验。由于原培养基含有30 g/L NaCl，因此混合液的NaCl终浓度理论值分别为20、25、30、35、40、45、50 g/L。

1.2.5 NaCl浓度对副溶血性弧菌生长的影响分别取5 mL副溶血性弧菌种子液接入含NaCl浓度分别为30、35、40、45、50 g/L的APW培养基，于37 ℃、120 r/min摇床培养24 h，然后测定各培养液副溶血性弧菌数。

1.2.6 副溶血性弧菌4 ℃保藏条件验证分别取1 mL副溶血性弧菌种子液接入45 g/L NaCl-APW培养基，于37 ℃、120 r/min摇床培养24 h，然后置于4 ℃冰箱保藏，间隔30 d取样测定副溶血性弧菌数；从副溶血性弧菌斜面挑取1环菌苔于45 g/L NaCl-APWA斜面，于37 ℃恒温培养24 h，加入5 mL无菌45 g/L NaCl溶液覆盖斜面的菌苔，然后置于4 ℃冰箱保藏，间隔30 d摇匀后用接种环随机沾取菌悬液1环于45 g/L NaCl-APWA斜面和TCBS斜面进行划线，于37 ℃恒温培养24 h，定性观察副溶血性弧菌数生长情况。

2 结果与分析

2.1 保护剂对副溶血性弧菌保藏的影响

不同保护剂对副溶血性弧菌保藏的影响见图1。由图1可知，加无菌水和30 g/L NaCl 25 ℃保藏较4 ℃和-20 ℃保藏残存的副溶血性弧菌活菌数高，但由于副溶血性弧菌在25 ℃仍处于旺盛的代谢繁殖状态，在保藏过程中一直处于不断分裂，传代次数越多，菌种发生变异的几率也越大，因此仍以低温保藏更具价值。图1显示，4 ℃和-20 ℃低温保藏条件下，加无菌水组的细胞存活率非常低，而加30 g/L NaCl组的细胞存活率较高，保藏30 d，残存活菌数仍可达到107。结果表明，一定浓度的NaCl有利于减缓副溶血性弧菌的冷伤害。

甘油常作为菌种冷冻保藏的冷冻保护剂，添加40 g/L甘油和30 g/L NaCl-40 g/L甘油复合溶液的试验组结果显示，甘油对副溶血性弧菌影响很大，25 ℃保藏30 d已检测不到活菌，虽然4 ℃和-20 ℃保藏30 d仍有副溶血性弧菌存活，但残存活菌数很低，已由原来的108下降到103。从方便使用和短期保藏的角度考虑，选择NaCl作为保护剂，对副溶血性弧菌4 ℃保藏条件进行进一步探讨。

2.2 NaCl浓度对副溶血性弧菌保藏的影响

由图2可知，4 ℃保藏条件下，保藏菌液NaCl终浓度对副溶血性弧菌影响较大。当NaCl浓度低于45 g/L，随着NaCl浓度的增加，副溶血性弧菌的存活细胞数也增加；当NaCl浓度超过45 g/L，副溶血性弧菌的存活细胞数呈下降趋势。当NaCl终浓度为45 g/L时，保藏效果最佳，保藏30、60、90 d副溶血性弧菌的存活细胞数分别达到107、106和105。因此，选择保藏菌液的NaCl终浓度为45 g/L较为适宜。

2.3 NaCl浓度对副溶血性弧菌生长的影响

图2已表明保藏菌液的NaCl终浓度为45 g/L时有利于副溶血性弧菌4 ℃保藏，图3对不同浓度NaCl对副溶血性弧菌生长的影响进行了探讨，结果表明，当APW培养基的NaCl浓度在30～50 g/L范围内，副溶血性弧菌均生长良好。因此，结合图2和图3的结果，选择45 g/L NaCl-APW作为培养基对副溶性血孤菌进行培养，培养后直接置于4 ℃进行保藏即可。

2.4 副溶血性弧菌4 ℃保藏条件验证

从图4可见，采用45 g/L NaCl-APW培养基培养后直接置于4 ℃冰箱进行保藏，保藏90 d，副溶血性弧菌的存活细胞数仅由109下降到106。

采用45 g/L NaCl溶液覆盖斜面的菌苔，于4 ℃保藏90 d，以接种环沾取菌悬液划线接种，结果保藏的菌种在TCBS斜面和45 g/L NaCl-APWA斜面上均生长良好。

验证结果表明，将副溶血性弧菌细胞置于45 g/L NaCl溶液或含45 g/L NaCl的培养基中进行4 ℃保藏，可有效防止低温对细胞的冷伤害，4 ℃保藏可达90 d。

3 小结与讨论

甘油对副溶血性弧菌有副作用，不宜作为副溶血性弧菌的冷冻保藏的保护剂。NaCl对副溶血性弧菌4 ℃保藏有保护作用，其中以45 g/L NaCl保护效果最佳，而且45 g/L NaCl不影响副溶血性弧菌的生长。将副溶血性弧菌细胞浸于45 g/L NaCl溶液或以含45 g/L NaCl的液体培养基培养后直接于4 ℃保藏，可有效防止低温对细胞的冷伤害，保藏90 d，副溶血性弧菌活菌数仅由初始的109下降至106。副溶血性弧菌4 ℃保藏具体方法可通过2种方式实现：①先以45 g/L NaCl-APWA斜面培养，再以5 mL 45 g/L无菌NaCl溶液覆盖，然后置于4 ℃保藏；②以45 g/L NaCl-APW液体培养基培养，取出直接4 ℃保藏。其中以②保藏法更为方便。

4 ℃斜面菌种保藏法具有方法简便、使用方便、条件容易实现等优点，已成为菌种短期保藏常用的方法，然而副溶血性弧菌斜面于4 ℃保藏15～30 d，副溶血性弧菌就因发生菌种死亡或转变为不可培养状态而难以再活化，实际工作中往往造成研究中断或需要反复购买标准菌株，菌种保藏难的这一问题一直困扰着研究和检验人员。本研究表明，NaCl浓度对副溶血性弧菌影响较大，以含45 g/L NaCl的液体保藏方式，4 ℃可保藏3个月。该方法简便，可以通过以45 g/L NaCl-APW液体培养基培养后取出置于4 ℃保藏或以45 g/L无菌NaCl溶液覆盖副溶血性弧菌斜面后置于4 ℃保藏2种简便方法实现低温保藏，该法可供研究和检验人员借鉴。

甘油是菌种冷冻保藏的常用冷冻保护剂，已为广大学者普遍认同，然而本研究发现甘油对副溶血性弧菌的存活影响很大，无论是室温、4 ℃或-20 ℃保藏条件下，甘油都对副溶血性弧菌的存活均不利，其原因有待进一步研究。

本研究主要从副溶血性弧菌的存活角度进行研究，解决了4 ℃保藏条件下菌种的存活问题，但4 ℃保藏条件是否对副溶血性弧菌的毒力或生化生理性质有影响，尚需进一步研究。

参考文献：

[1] 刘秀梅，陈艳，王晓英，等.1992～2001年食源性疾病暴发资料分析–国家食源性疾病监测网[J].卫生研究，2004，33（6）： 725-727.

[2] QUILICI M L， ROBERT-PILLOT A， PICART J， et al. Pandemic Vibrio parahaemolyticus O3：K6 spread， France[J]. Emerging Infectious Diseases， 2005，15（11）：1148-1149.

[3] 伦镜盛，夏常艳，罗鹏，等.副溶血弧菌EMA-PCR检测技术的建立[J].微生物学通报，2011，38（6）：952-956.

[4] 马月姣，孙晓红，赵勇，等.REP-PCR及ERIC–PCR法对分离自海产品副溶血性弧菌分型分析[J].食品科学，2013，34（10）：263-267.

[5] 唐晓阳，韩婷，谢晶，等.不同致病性副溶血性弧菌在南美白对虾中的生长动力学参数比较研究[J].食品工业科技， 2013，34（2）：78-82.

[6] 储卫华，朱卫，康春涛，等.海洋蛭弧菌的分离鉴定及其对副溶血弧菌的作用[J].微生物学通报，2009，36（1）：20-24.

[7] 李强，吴葵，张菊梅，等.副溶血性弧菌群体感应蛋白CqsA 的原核表达[J].生物技术通报，2012（1）：89-93.

[8] HENKE J M， BASSLER B L. Quorum sensing regulates type III secretion in Vibrio harveyi and Vibrio parahaemolyticus[J]. Journal of Bacteriology， 2004，186（12）： 3794-3805.

[9] 鲁晓晴，张超英，周晓彬，等.大蒜液和食醋对副溶血性弧菌杀灭效果的试验研究[J].中国消毒学杂志，2007，24（1）：48-50.

[10] OTTAVIANI D，LEONI F，SERRA R. Nontoxigenic Vibrio parahaemolyticus strains causing acute gastroenteritis[J]. Journal of Clinical， 2012，50（12）：4141-4143.

[11] KADHIM H M， MIAH A， MUNN C B， et al. Development of a polymerase chain reaction（PCR） test for the detection of virulent forms of Vibrio parahaemolyticus[J]. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases， 2012，31（4）：431-439.

[12] 杜萌，陈吉祥，孙丰蓉，等.低温寡营养条件下副溶血弧菌形成活的非可培养状态及其复苏研究[J].水生生物学报， 2008，32（2）：178-181.

[13] WONG H C， SHEN C T， CHANG C N， et al. Biochemical and virulence characterization of viable but nonculturable cells of Vibrio parahaemolyticus[J]. Journal of Food Protection， 2004， 67（11）：2430-2435.

[14] GB/T 4789.7-2013.食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验[S].