文 峰，陈 兰，程建国，霞 明

(1.解放军第161医院 消化内科，湖北武汉，430010;2.湖北省武汉市第六医院消化内科，湖北武汉，430015)

胃癌是中国最常见的恶性肿瘤之一，其浸润、转移是患者的主要致死原因。肿瘤的侵袭转移过程涉及多个基因的改变。Ezrin是ERM(Ezrin，radixin，moesin)家族的成员，作为骨架连接蛋白能与黏附分子连接，参与调节信号转导并有维持细胞形态和运动等多种功能。近年来Ezrin在肿瘤浸润生长与侵袭转移中的作用受到关注［1－2］。CD44作为一个跨膜糖蛋白，参与细胞的黏附及迁移，在肿瘤转移和侵袭中表达增加。本文采用免疫组化法检测人体胃癌标本中Ezrin、CD44的阳性表达，旨在探讨Ezrin、CD44对癌细胞分化和黏附的影响及其对胃癌浸润、转移的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料

采集2008—2010年解放军161医院病理诊断为胃癌的手术标本64例，有50例附癌旁组织。其中男40例，女24例，年龄42～74岁。依据WHO胃肿瘤分类标准(2002年)将其分类:管状腺癌46例，乳头状腺癌11例，腺鳞癌4例，未分化癌3例。为便于统计，把乳头状腺癌和高分化管状腺癌一同列入高分化腺癌组，把未分化癌列入低分化腺癌组，并将中分化腺癌组和高分化腺癌组列为一组。

1.2 试验试剂

鼠抗人Ezrin单克隆抗体(NewoMarkers公司)，鼠抗人CD44单克隆抗体及兔抗人actin单克隆抗体(福州迈新试剂公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 标本处理:每例组织用40 g/L甲醛固定后石蜡包埋，4 μm连续切片10张，取2张切片分别作Ezrin、CD44免疫组织化学染色，1张行HE染色作光镜下诊断复查，剩余备用。

1.3.2 免疫组化:标本切片常规脱蜡置水，用pH6.0的柠檬酸盐缓冲液高压修复抗原，先后用过氧化物酶及小牛血清处理抗原，Ⅰ抗室温下孵育1 h后分别滴加Ⅱ、Ⅲ抗，行DAB显色。以PBS液替代I抗作阴性对照，阳性对照用已知阳性标本。苏木素复染细胞核。Ezrin在胞质内呈棕色颗粒，CD44v6在细胞膜上呈棕黄色的线状分布。根据染色强度和阳性表达细胞数，参考Mathew分级标准:阴性(－)，无阳性细胞者;阳性(+)，＜50%细胞阳性表达或染色较浅;强阳性(2+)，≥50%细胞阳性表达且深染。

1.3.3 蛋白提取:Western-blotting裂解细胞提取蛋白，测定蛋白浓度并取 50 g的蛋白，10%不连续，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，60V恒压电流下转移2 h至PVDF膜，将膜在室温下摇动封闭1 h，将Ⅰ抗用含5%脱脂奶粉稀释至适当浓度(1∶1000～1∶5000)，将膜于Ⅰ抗中室温孵育2 h后回收Ⅰ抗，在室温下漂洗将辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗稀释至1∶1000，将膜于Ⅱ抗中室温下孵育2 h，室温下漂洗，ECL显色，暗室曝光显影蛋白的相对表达量取目的蛋白与actin的灰度比。

1.4 统计学分析

采用SPSS 18.0作数据统计。各组指标与临床病理间的关系用χ2检验和Spearman等级相关分析，P＜0.05有统计学差异。

2 结果

2.1 Western-blotting检测

在胃癌组织中，Ezrin与CD44v6呈明显高表达。见图1。

图1 胃癌组织中Ezrin与CD44v6表达的Western-blotting检测

2.2 免疫组化染色

2.2.1 Ezrin表达特点:Ezrin在64例癌组织中阳性表达率为60.9%。Ezrin主要沿细胞膜内侧线性分布，在胞质中呈棕色颗粒，在肿瘤组织中从局灶性至弥漫性均有表达(见图2)，以弥漫性表达为主，在癌周组织中的阳性表达也以弥漫性为主，但表达率显著低于肿瘤组织(P＜0.01);低分化胃癌Ezrin阳性表达率显著高于高分化胃癌(P＜0.05);在有淋巴结转移的癌组织中Ezrin阳性率也明显增高(P＜0.05);在不同性别和浸润深度的2组间阳性表达无显著差异，提示Ezrin表达与性别和浸润深度不相关(P＞0.05)。

2.2.2 CD44v6表达特点:CD44v6在 64 例胃癌组织中阳性表达率为65.6%。CD44v6阳性表达呈棕黄色，多定位在细胞膜和胞质上(见图 3)，在肿瘤组织表达阳性率明显高于癌周组织(P＜0.05);在低分化胃癌表达显著高于高分化胃癌(P＜0.05);在侵及浆膜及浆膜外者阳性表达率较侵及肌层者明显增高(P＜0.05);在有淋巴结转移的癌组织中阳性表达率显著增高(P＜0.05)。见表1。

图2 Ezrin在胃癌组织中的阳性表达

图3 CD44v6在胃癌组织中的阳性表达

2.3 Ezrin、CD44表达的相关性

两者在胃癌组织中的表达密切相关(χ2=17.580，P=0.000)。Spearman 等级相关分析提示Ezrin表达与CD44表达呈正相关(r=0.303，P＜0.05)。

2.4 Ezrin/CD 44的联合表达与胃癌浸润和转移

在Ezrin(－)/CD44(－)的15例癌标本中，6例浸润至浆膜层(40%)，4例发生淋巴结转移(26.7%);而在 Ezrin(+)/CD44(+)的26例癌标本中，15例浸润至浆膜层(57.7%)，16例发生淋巴结转移(61.5%)。两者比较差异均有统计学意义，P 分别为0.043和0.016。

3 讨论

Ezrin蛋白和ERM家族其他成员有着高度(75% ～80%)同源性，其基因位于染色体6q25.2-q26，mRNA长3166bp，共编码585个氨基酸。Ezrin蛋白表达具有相对的细胞及组织特异性，常和Moesin(膜突蛋白)、Radixin(根蛋白)在细胞膜内面共同表达，维持细胞形态和生存，并参与许多疾病的发病过程。Ezrin蛋白通过与某些肿瘤细胞表面黏附分子的相互作用，调节肿瘤细胞的某些特性，从而对肿瘤细胞的分化、侵袭和转移产生重要影响［3］。许多肿瘤组织中都可检测到Ezrin的高表达。Meng等［4］的实验结果表明，Ezrin的高表达能够促进胰腺癌细胞的侵袭、转移能力，从而促进胰腺癌转移。Gschwantler-Kaulich D等［5］在研究乳腺癌时发现，Ezrin在乳腺浸润性导管癌中的表达明显高于其良性病变中的表达，其中有淋巴结转移者更为明显，提示Ezrin对乳腺癌的发生和淋巴结转移有重要的影响。本组研究结果提示，Ezrin在胃癌中的表达显著增高，而且其阳性表达与胃癌的分化程度及淋巴结转移情况密切相关，提示Ezrin蛋白很可能参与了胃癌的发生和转移的全过程。随着Ezrin在不同肿瘤中表达水平的深入研究，Ezrin有可能成为提示多种肿瘤预后或者转移的分子标记物。

CD44是一个多功能的细胞表面黏附分子，在细胞表面分布广泛，参与细胞信号转导的重要环节，与肿瘤细胞的增生、迁移、侵袭密切相关［6－7］。近来研究表明，Ezrin与CD44这类膜受体蛋白分子有极为复杂的相互作用［8］。Ezrin的高表达可能参与肿瘤转移全过程的多个环节，从原发灶癌细胞脱落、侵入周围组织、播散入脉管系统、透过基底膜、在靶器官增殖形成转移灶等，Ezrin有可能作为肿瘤细胞转移过程中各个环节、各条通路的中心调控因素而发挥关键作用。研究发现，肝细胞生长因子刺激后CD44的过度表达会导致Ezrin集中，而Ezrin改变CD44的胞质尾区并结合后与细胞骨架蛋白相互作用，是肿瘤转移的前提条件［9］。

免疫组化实验及Western-blotting检测结果证实，Ezrin、CD44的阳性表达在癌组织和癌旁组织中都存在明显的差异，Ezrin、CD44的阳性表达在胃癌组织中显著增高，表达程度随着肿瘤分化程度降低而增高，提示两者与胃癌发生、发展和分化密切相关。Ezrin、CD44在伴有淋巴结转移的胃癌组织中的阳性表达显著高于无淋巴结转移的病例，提示Ezrin、CD44可能共同参与了胃癌的淋巴结的转移过程。而CD44与Ezrin的阳性表达密切相关，也提示Ezrin可能需要通过与肿瘤转移有关的黏附分子协同发挥作用。因此，临床对二者进行联合检测可能作为对胃癌转移及预后的重要预测指标。

［1］Persson A，Lindwall C，Curtis M A，et al.Expression of ezrin radixin moesin proteins in the adult subventricular zone and the rostral migratory stream［J］.Neuroscience，2010，167(2):312.

［2］Wu G，Sun X，Yuan H，et al.Ezrin Gene Expression and Protein Production in the CD44+Subpopulation of SCC-9 Cells in a Malignant Oral Cancer Cell Line In Vitro［J］.Journal of Oral and Maxillofacial Surgery，2013，7(13):e151.

［3］Tian T，Lindell S L，Lam M，et al.Ezrin functionality and hypothermic preservation injury in LLC-PK1 cells［J］.Cryobiology，2012，65(1):60.

［4］Meng Y，Lu Z，Yu S，Zhang Q，Ma Y，Chen J.Ezrin promotes invasion and metastasis of pancreatic cancer cells［J］.J Transl Med.2010，23(8):61.

［5］Gschwantler-Kaulich D，Natter C，Steurer S，et al，Increase in ezrin expression from benign to malignant breast tumours［J］.Cell Oncol(Dordr)，2013，36(6):485.

［6］Hiraga T，Ito S，Nakamura H.Cancer stem-like cell marker CD44promotes bone metastases by enhancing tumorigenicity，cell motility，and hyaluronan production［J］.Cancer Res.2013，73(13):4112.

［7］Blacking T M，Waterfall M，Argyle D J.CD44is associated with proliferation，rather than a specific cancer stem cell population，in cultured canine cancer cells［J］.Veterinary Immunology and Immunopathology.2011，141(1/2):46.

［8］Matsumoto T，Imagama S，Hirano K，et al.CD44expression in astrocytes and microglia is associated with ALS progression in a mouse model［J］.Neuroscience Letters，2012，520(1):115.

［9］Griffith J S，Liu Y G，Tekmal R R，et al.Menstrual endometrial cells from women with endometriosis demonstrate increased adherence to peritoneal cells and increased expression of CD44splice variants［J］.Fertil Steril，2010，93(6):1745.