杜婷，杜士明，王刚，孙荣进，杨光义，叶方，袁玲玲，刘涛

(1.湖北医药学院附属太和医院药学部，十堰 442000;2.湖北医药学院药学院，十堰 442000;3.湖北医药学院附属太和医院病理科，十堰 442000)

柴胡是我国传统中药，临床应用广泛，具有解热、镇痛、抗炎、增强免疫、保肝利胆、抗菌、抗病毒及抗肿瘤等作用[1-2]。《中华人民共和国药典》(2010年版)收载的柴胡品种为北柴胡(Bupleurum chinense DC.)或狭叶柴胡(B.scorzonerifolium Willd.)的干燥根，而市场对柴胡需求量很大，北柴胡药用植物资源的供应相对缺乏。本课题组对鄂西北地区柴胡资源调查结果表明，本地区野生柴胡品种均为竹叶柴胡，尚未发现有野生和人工栽培的北柴胡[3]。前期研究表明，本产地竹叶柴胡质量均符合《中华人民共和国药典》规定[4]，笔者在此基础上进一步比较竹叶柴胡和北柴胡的抗炎及保肝作用，为合理地开发和综合利用柴胡药用植物资源及其临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物 斯波雷格·多雷(Sprague Dawley，SD)大鼠，SPF级，体质量(200±20)g，雌雄各半，合格证号:4200900016;昆明种小鼠，SPF级，体质量(20±2)g，雌雄各半，合格证号:4200900014，实验动物生产许可证号:SYXK(鄂)2011-0031，均由湖北医药学院动物实验中心提供。

1.2 试药与试剂 竹叶柴胡由湖北神农本草中药饮片有限公司种植基地提供(批号:20111220);北柴胡由山西省运城县北柴胡种植基地提供(批号:20111020)，经湖北中医药大学陈科力教授鉴定分别为竹叶柴胡(Bupleurum marginatum Wall.ex DC.)、北柴胡(Bupleurum chinense DC.);柴胡水煎剂的制备:柴胡药材分别经水煎煮、浓缩成每毫升含生药0.5 g的竹叶柴胡水煎液和北柴胡水煎液;0.9%氯化钠溶液，安徽环球药业有限公司，批号:A120308F;二甲苯，武汉市江北化学试剂有限公司，批号:20051121;四氯化碳(CCl4)，天津市天力化学试剂有限公司，批号:20121009;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)测定试剂盒，均由南京建成生物工程公司提供(批号分别为:20121021，20110401，20120203)。

1.3 仪器 JJ200电子天平(美国兄弟公司)，MH-1000调温型电热套(北京科伟永兴仪器有限公司)，RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，FA-200电子分析天平(上海精密仪器厂)，千分尺(上海新滨量具厂)，AO820型石蜡切片机(美国)，光学显微镜(日本Olympus公司)。

1.4 抗炎实验

1.4.1 耳肿胀度实验 取小鼠60只，雌雄各半，随机分为6组，每组10只，分别为竹叶柴胡水煎液2.5，5.0 g·kg－1剂量组;北柴胡水煎液2.5，5.0 g·kg－1剂量组;正常对照组、模型对照组给予纯化水10mL·kg－1。均灌胃给药，每天1次，连续给药7d。末次灌胃给药45 min后，除正常对照组外，其余各组小鼠右耳涂二甲苯0.5mL致肿，60 min后脱颈椎处死，用8 mm打孔器分别在左右耳相同部位打下圆片，称质量，计算肿胀度和肿胀抑制百分率。肿胀度=右耳质量－左耳质量，(给药组)肿胀抑制率(%)=(模型对照组平均肿胀度－给药组平均肿胀度)/模型对照组平均肿胀度 ×100%[5]。

1.4.2 足肿胀实验 取大鼠40只，雌雄各半，随机分为5组，每组8只，分别为竹叶柴胡水煎液 2.5，5.0 g·kg－1剂量组;北柴胡水煎液2.5，5.0 g·kg－1剂量组;模型对照组给予纯化水10mL·kg－1。上述5组灌胃给药，每天1次，连续给药3 d。实验前用千分尺测量大鼠左后足趾厚度并记录。末次给药1h后，于大鼠左后足跖皮下注射10%蛋清0.1mL致炎，致炎后0.5，1，2，4，6 h 测量致炎左后足趾厚度1 次，并计算肿胀度和肿胀抑制率。肿胀率(%)=(致炎后足趾厚度－致炎前足趾厚度)/致炎前足趾厚度×100%;肿胀抑制率(%)=(模型对照组平均肿胀率－给药组平均肿胀率)/模型对照组平均肿胀率×100%。

1.5 对CCl4所致小鼠肝损伤模型的保护作用 取实验用小鼠60只，雌雄各半，随机分为6组，每组10只，分别为竹叶柴胡水煎液 2.5，5.0 g·kg－1剂量组;北柴胡水煎液 2.5，5.0 g·kg－1剂量组;正常对照组;模型对照组。各给药组分别灌胃给药，每天1次，连续给药7d，正常对照组、模型对照组给予同等体积的纯化水，末次给药后禁食不禁水，1h后除正常对照组腹腔注射等量的0.9%氯化钠溶液外，其余各组小鼠均腹腔注射0.1%CCl4花生油溶液0.01mL·g－1。造模16 h后摘眼球取血，常规分离血清及肝组织，备用[6-7]。

1.5.1 血清生化指标检测 取备用血清按试剂盒说明操作，测定丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、碱 性 磷 酸 酶 (alkaline phosphatase，ALP)含量。

1.5.2 肝组织生化指标 取肝组织，用冰冷0.9%氯化钠溶液冲去血渍，滤纸吸干水分，加TMS缓冲液制得100 g·L－1肝匀浆，4 ℃，12261 ×g离心20 min，取上清液备用，按试剂盒说明操作，测定SOD、MDA、GSH的含量。

1.5.3 病理组织学及免疫组化观察 留取部分肝组织于4%多聚甲醛固定液固定，常规石蜡包埋、脱水，切片。苏木精-伊红染色，光镜下观察肝细胞病理形态学改变。免疫组化S-P法检测大鼠肝组织转化生长因子 β(transforming growth factor-β，TGF-β)、核因子-κB(nuclear factor kappB，NF-κB)蛋白的表达。

2 结果

2.1 抗炎实验

2.1.1 耳肿胀度实验 结果见表1。竹叶柴胡和北柴胡5.0 g·kg－1剂量组与模型对照组比较均差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，表明竹叶柴胡与北柴胡对二甲苯所致小鼠耳肿胀有抑制作用。但两者比较差异无统计学意义(P＞0.05)，表明二者对小鼠耳肿胀的抑制作用相近。竹叶柴胡和北柴胡2.5 g·kg－1剂量组与模型对照组比较，略有改善，但均差异无统计学意义(均 P ＞0.05)，说明两种柴胡 2.5 g·kg－1剂量对二甲苯所致小鼠耳肿胀无明显抑制作用。

2.1.2 足趾肿胀实验 结果见表2。竹叶柴胡和北柴胡5.0 g·kg－1剂量组在 2.0，4.0，6.0 h 时与模型对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05或 P＜0.01)，表明二者可抑制大鼠足趾肿胀，但两者肿胀率差异无统计学意义(P ＞0.05)。在 2.0，4.0，6.0 h 时，2.5 g·kg－1北柴胡的肿胀抑制率分别为30.87%，19.42%，23.18%;竹叶柴胡的肿胀抑制率分别为7.12%，10.07%，9.59%。竹叶柴胡和北柴胡水煎液在5.0 g·kg－1呈现较强的抗炎作用，竹叶柴胡2.5 g·kg－1抗炎作用较弱。

2.2 对CCl4所致小鼠肝损伤模型的保护作用

2.2.1 血清生化指标检测 见表3。结果显示正常对照组与模型对照组比较差异有统计学意义，说明CCl4致小鼠急性肝损伤造模成功。治疗组ALP与模型对照组比较均差异无统计学意义(均P＞0.05);竹叶柴胡5.0 g·kg－1组ALT与模型对照组比较差异无统计学意义(P ＞0.05)，北柴胡5.0 g·kg－1组 ALT 与模型对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05);竹叶柴胡、北柴胡2.5 g·kg－1组 ALT、AST 与模型对照组比较均差异有统计学意义(均P＜0.05)，且两者ALT、AST值差异无统计学意义(P＞0.05)，表明竹叶柴胡、北柴胡在2.5 g·kg－1有保护CCl4所致小鼠急性肝损伤作用，且作用相近。

2.2.2 肝组织生化指标 见表4。结果显示正常对照组与模型对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，表明造模成功。竹叶柴胡和北柴胡5.0 g·kg－1组MDA含量与模型对照组比较明显下降(P＜0.05)，2.5 g·kg－1组与模型对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);竹叶柴胡和北柴胡各剂量组SOD、GSH含量与模型对照组比较均明显上升(均P＜0.05或P＜0.01)，竹叶柴胡与北柴胡相同剂量组间的SOD、GSH均差异无统计学意义(均P＞0.05)，表明竹叶柴胡、北柴胡5.0 g·kg－1均可提高肝组织抗氧化酶活性，抑制氧自由基引起的脂质过氧化。

表1 6组小鼠耳肿胀情况比较Tab.1 Comparison of ear swelling among six groups of mice mg，

表1 6组小鼠耳肿胀情况比较Tab.1 Comparison of ear swelling among six groups of mice mg，

与正常对照组比较，*1 P ＜0.05;与模型对照组比较，*2 P＜0.05，*3 P ＜0.01Compared with normal control group，*1 P ＜0.05;compared with model control group，*2 P ＜0.05，*3 P ＜0.01

率/%正常对照组 10 … 3.75±0.93 3.90±0.83 0.17±0.33组别 小鼠/只剂量/(g·kg－1) 左耳质量 右耳质量 肿胀度 肿胀抑制…模型对照组 10 … 4.37±0.54 6.25±0.44 1.87±0.31*1 …竹叶柴胡水煎液组 10 2.5 5.60 ±1.36 7.13 ±0.78 1.50 ±0.66 18.70 ±9.0210 5.0 6.54 ±0.63 7.54 ±0.68 1.00 ±0.22*2 46.70 ±12.30北柴胡水煎液组 10 2.5 5.06 ±0.70 6.44 ±1.46 1.50 ±0.55 20.00 ±8.9710 5.0 5.50 ±1.31 6.14 ±1.24 0.64 ±0.15*3 65.80 ±11.80

表2 5组大鼠足趾肿胀不同时间点的肿胀率比较Tab.2 Comparison of the swelling rate of toes among six groups of rats at different time points %，

表2 5组大鼠足趾肿胀不同时间点的肿胀率比较Tab.2 Comparison of the swelling rate of toes among six groups of rats at different time points %，

与模型对照组比较，*1 P ＜0.05，*2 P ＜0.01Compared with model control group，*1 P ＜0.05，*2 P ＜0.01

组别 大鼠/只0.5 h 1.0 h 2.0 h 4.0 h 6.0 h剂量/(g·kg－1)模型对照组 8 … 56.56±3.20 58.24±9.60 54.16±9.30 52.60±7.60 47.10 ±7.20竹叶柴胡水煎液组 8 2.5 45.40 ±10.60 51.88 ±11.80 50.30 ±8.60 47.30 ±2.60 42.58 ±5.8085.0 51.38 ±8.60 55.02 ±5.70 41.26 ±6.60*1 36.98 ±7.00*1 27.52 ±2.80*2北柴胡水煎液组 8 2.5 51.80 ±15.50 53.20 ±21.70 37.44 ±15.50*1 42.38 ±17.80*1 36.18 ±10.30*1 85.0 48.74 ±6.50 55.76 ±8.90 37.16 ±8.10*1 27.56 ±5.30*2 24.26 ±2.40*2

表3 6组小鼠血清ALT、AST和ALP的含量比较Tab.3 Comparison of the serum level of ALT，AST and ALP among six groups of mice U·L－1，

表3 6组小鼠血清ALT、AST和ALP的含量比较Tab.3 Comparison of the serum level of ALT，AST and ALP among six groups of mice U·L－1，

与正常对照组比较，*1 P＜0.05;与模型对照组比较，*2 P＜0.05Compared with normal control group，*1 P ＜0.05;compared with model control group，*2 P ＜0.05

ALT AST ALP正常对照组 10 …组别 小鼠/只 剂量/(g·kg－1)163.50 ±56.32 379.50 ±104.30 202.00 ±62.53模型对照组 10 … 345.80±112.70*1 508.40±123.60*1 156.80±53.26*1竹叶柴胡水煎液组 10 2.5 213.00 ±82.14*2 313.25 ±86.19*2 172.00 ±69.5810 5.0 323.00 ±91.46 481.60 ±96.43 143.60 ±32.76北柴胡水煎液组 10 2.5 152.67 ±48.62*2 373.67 ±102.60*2 150.30 ±48.7910 5.0 191.50 ±65.13*2 474.00 ±134.61 129.30 ±53.68

表4 6组小鼠肝组织SOD、MDA、GSH的含量比较Tab.4 Comparison of hepatic content of SOD，MDA and GSH among six groups of mice

表4 6组小鼠肝组织SOD、MDA、GSH的含量比较Tab.4 Comparison of hepatic content of SOD，MDA and GSH among six groups of mice

与正常对照组比较，*1 P ＜0.05;与模型对照组比较，*2 P＜0.05，*3 P ＜0.01Compared with normal control group，*1 P ＜0.05;compared with model control group，*2 P ＜0.05，*3 P ＜0.01

组别 小鼠/只 剂量/(g·kg－1)SOD GSH(U·g－1)MDA/(nmol·mL－1)正常对照组 10 …156.43 ±7.23 112.59 ±19.35 3.67 ±0.43模型对照组 10 … 67.25±12.04*1 78.33±15.56*1 6.34±1.01*1竹叶柴胡水煎液组 10 2.5 92.34 ±8.45*2 99.29 ±25.53*2 5.02 ±0.5310 5.0 105.65 ±14.90*3 106.65 ±13.56*3 4.28 ±0.34*2北柴胡水煎液组 10 2.5 97.12 ±6.47*2 104.35 ±18.23*3 5.18 ±0.3610 5.0 113.00 ±12.64*3 121.45 ±25.12*3 4.01 ±0.42*2

2.2.3 病理组织学结果 见图1。正常对照组肝组织无异常病变，肝小叶结构清晰完整，肝细胞索排列整齐，无肝细胞脂肪变性、坏死，无炎细胞浸润。模型对照组肝组织损伤严重，细胞排列紊乱，部分肝窦消失，肝小叶结构破坏，中央静脉周围可见少量坏死肝细胞，有炎细胞浸润，肝细胞明显肿胀、变性、细胞质疏松，多为脂肪样变性，可见碎片状坏死。竹叶柴胡水煎液组和北柴胡水煎液组脂肪变性较少，炎细胞浸润较模型对照组减轻;5.0 g·kg－1组较2.5 g·kg－1组炎细胞浸润较轻，肝细胞脂肪变性较少。结果表明竹叶柴胡和北柴胡水煎液对CCl4致小鼠急性肝损伤均有治疗作用。

2.2.4 免疫组化结果 见图2。正常对照组肝组织只有少量TGF-β阳性表达，着色较浅，范围较窄(图2A);而模型对照组TGF-β阳性表达较强，阳性染色多见于汇管区病变肝细胞胞质内，细胞质呈棕黄色散在分布，阳性表达密度高于正常对照组(图2B);竹叶柴胡和北柴胡水煎液组与模型对照组比较，TGF-β阳性表达均有不同程度的减轻，表明了竹叶柴胡和北柴胡均能抑制肝损伤小鼠肝组织TGF-β阳性表达;而竹叶柴胡和北柴胡水煎液5.0 g·kg－1组 TGF-β阳性表达分别低于两者的水煎液2.5 g·kg－1组，竹叶柴胡与北柴胡水煎液组TGF-β阳性表达无显著性差异。

A.正常对照组;B.模型对照组;C.竹叶柴胡水煎液 2.5 g·kg－1组;D:竹叶柴胡水煎液 5.0 g·kg－1组;E.北柴胡水煎液2.5 g·kg－1组;F.北柴胡水煎液 5.0 g·kg－1组图1 6组小鼠肝脏病理组织学检查结果(×200)A.normal control group;B.model control group;C.2.5 g·kg－1 Bupleurum marginatum Wall.ex DC.group;D.5.0 g·kg－1 Bupleurum marginatum Wall.ex DC.group;E.2.5 g·kg－1 Bupleurum chinense DC.group;F.5.0 g·kg－1 Bupleurum chinense DC.groupFig.1 Hepatic histopathology of six groups of mice(×200)

正常对照组肝组织NF-κB阳性表达较少，见于细胞质内、着色较浅(图3A);而模型对照组肝组织NF-κB阳性表达较强，阳性反应的部位多见于汇管区病变肝细胞胞质内，血管周围部分脂肪变性的肝细胞，呈棕黄色颗粒(图3B);竹叶柴胡和北柴胡给药组NF-κB阳性表达明显低于模型对照组(图3)，但高于空白组，表明竹叶柴胡和北柴胡均有保肝作用;北柴胡剂量组NF-κB阳性表达低于竹叶柴胡剂量组，差异无统计学意义。

3 讨论

血清生化指标和肝组织生化指标实验结果显示，竹叶柴胡和北柴胡2.5 g·kg－1组对CCl4实验性肝损伤小鼠有促进肝内脂质代谢的作用，使ALT、AST含量降低，SOD、GSH含量升高，表明竹叶柴胡和北柴胡通过减少氧自由基拮抗肝脏损伤，这与其他学者的结论一致[8]。竹叶柴胡和北柴胡均不同程度地下调TGF-β的表达，提示柴胡能通过抑制TGF-β合成，阻断其信号途径，减轻肝星状细胞活化程度，缓解肝纤维化。同时，TGF-β 的合成受核转录因子 NF-κB 等的调控[9]。本研究结果显示竹叶柴胡和北柴胡可抑制NF-κB的表达。NF-κB与DNA接触，可启动许多基因的转录，调控的基因可以编码急性反应蛋白、细胞黏附分子等，其中包括肿瘤坏死因子α和β、粒-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素6等，通过调控它们的转录过程，直接参与肝脏炎症、肝细胞再生和凋亡等病理生理过程[10]。本实验在考察竹叶柴胡与北柴胡的抗炎保肝作用的基础上，探讨了两者保肝作用机制，为进一步阐明柴胡药理作用提供参考。

在本研究中血清生化指标AST、ALT、ALP的变化与柴胡水煎液的剂量不成正比，在2.5 g·kg－1时能显著降低 AST、ALT 的指标，但是 5.0 g·kg－1时效果不显著，可能与柴胡剂量过大产生了急性肝毒性有关，导致 AST、ALT 值偏高[11]。

A.正常对照组;B.模型对照组;C.竹叶柴胡水煎液 2.5 g·kg－1组;D.竹叶柴胡水煎液 5.0 g·kg－1组;E.北柴胡水煎液2.5 g·kg－1组;F.北柴胡水煎液 5.0 g·kg－1组图2 6组小鼠TGF-β表达结果(×400)A.normal control group;B.model control group;C.2.5 g·kg－1 Bupleurum marginatum Wall.ex DC.group;D.5.0 g·kg－1 Bupleurum marginatum Wall.ex DC.group;E.2.5 g·kg－1 Bupleurum chinense DC.group;F.5.0 g·kg－1 Bupleurum chinense DC.groupFig.2 TGF-β expression of six groups of mice(×400)

A.正常对照组;B.模型对照组;C.竹叶柴胡水煎液 2.5 g·kg－1组;D.竹叶柴胡水煎液 5.0 g·kg－1组;E.北柴胡水煎液2.5 g·kg－1组;F.北柴胡水煎液 5.0 g·kg－1组图36组小鼠NF-κB表达结果(×200)A.normal control group;B.model control group;C.2.5 g·kg－1 Bupleurum marginatum Wall.ex DC.group;D.5.0 g·kg－1 Bupleurum marginatum Wall.ex DC.group;E.2.5 g·kg－1 Bupleurum chinense DC.group;F.5.0 g·kg－1 Bupleurum chinense DC.groupFig.3 NF-κB expression of six groups of mice(×200)

本实验结果显示竹叶柴胡与北柴胡的水煎液在抗炎、保肝药理作用方面差异无统计学意义，结合前期质量评价分析结果[4]显示，竹叶柴胡与北柴胡在主要活性成分含量及药理作用方面均差异无统计学意义。

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