周璞，刁鑫伟，汤金梁，彭丽娜，张洪川，陈正堂

肺癌是当今世界发病率和病死率均居首位的恶性肿瘤[1]，虽然综合治疗水平不断提高，但患者5年生存率并无明显改善[2-3]。对肺癌发生、发展机制的深入研究可帮助我们寻找更好的治疗切入点。Rab25属于Rab蛋白家族，在调节信号转导、细胞增殖分化、囊泡运输、细胞骨架形成、胞吞作用等方面均发挥重要作用，特别是在调控细胞内囊泡运输方面起着关键的分子开关作用[4]。多项研究证实Rab25与肿瘤关系非常密切，它既是促癌因子又是抑癌因子[5-6]。本研究小组前期工作发现，在人肺腺癌干细胞表达上调的原癌基因中，Rab25上调倍数最大。本研究通过免疫组化法检测Rab25蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达，并分析其与NSCLC临床病理学特征的相关性，为进一步研究Rab25在NSCLC中的作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 标本 收集2009年1月－2010年6月第三军医大学新桥医院胸外科手术切除的NSCLC石蜡组织标本61例，癌旁组织40例。所有患者临床资料完整，术前均未接受过放化疗、生物治疗及其他治疗。术后立即切取标本，其中男45例，女16例，年龄56.2±9.1(33～72)岁，中位年龄58岁；鳞癌31例，腺癌26例，腺鳞癌4例；TNM分期Ⅰ期30例，Ⅱ－Ⅲ期31例。本研究通过第三军医大学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂 Rab25鼠单克隆抗体购自Abcam公司，山羊抗鼠二抗及免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。

1.3 免疫组化检测Rab25蛋白表达 采用两步法(MaxVisionTM)，步骤如下：所有标本经4%中性甲醛固定，石蜡包埋，2μm连续切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，3%过氧化氢封闭13min后置于柠檬酸缓冲液进行高压修复，冷却；滴加Rab25鼠单克隆抗体(1:500)，4℃孵育过夜；次日取出，37℃复温；加入过氧化物结合的山羊抗鼠二抗，室温孵育15min，DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，光学显微镜下检测并拍照。染色结果根据阳性细胞染色强度及阳性细胞百分数进行分级，每张切片随机观察5个高倍视野(×400)，每个视野观察100个细胞，阳性细胞百分数＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分；细胞染色强度：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色及深黄色为2分，褐色及深褐色为3分。阳性强度为两种积分乘积：0分为阴性(－)，1～4分为弱阳性()，5～8分为中度阳性()，9～12分为强阳性。最后积分＜6分定义为低表达，≥6分为高表达。结果判定由两位病理科医师按照双盲、独立的原则进行。

1.4 统计学处理 采用SPSS 21.0进行统计学分析，以行×列表资料χ2检验及校正χ2检验、秩和检验分析NSCLC与癌旁组织Rab25的表达差异，及Rab25表达与临床病理因素(性别、年龄，肿瘤大小、病理类型、分化程度、淋巴结转移、TNM分期)的关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Rab25蛋白的表达 免疫组化结果显示，在NSCLC的细胞膜和细胞质中均有Rab25表达，但细胞核中无表达(图1)。61例NSCLC组织中Rab25的阳性表达率为93.4%(57/61)，40例癌旁组织中Rab25的阳性表达率为27.5%(11/40)，两者表达差异有统计学意义(P＜0.01，表1)。

2.2 Rab25蛋白表达与临床病理因素的关系Rab25蛋白在患者性别、年龄、有无吸烟、组织类型、淋巴结转移、分化程度中的表达差异无统计学意义(P＜0.05)。肿瘤体积≥4cm患者的Rab25蛋白阳性表达率明显高于肿瘤体积＜4cm的患者(48.5%vs 21.4%，P=0.028)。Ⅱ－Ⅲ期患者Rab25蛋白阳性表达率高于Ⅰ期患者(48.4% vs 23.3%，P=0.042，表2)。

图1 NSCLC组织与癌旁组织中Rab25蛋白的表达(免疫组化)Fig. 1 Expression of Rab25 protein in NSCLC and adjacent normal tissues(Immunohistochemical staining)

表1 Rab25蛋白在NSCLC和癌旁组织中的表达Tab.1 Expression of Rab25 protein in NSCLC and adjacent normal lung tissue

表2 Rab25蛋白表达与NSCLC患者临床病理因素相关性(n=61)Tab.2 Correlation of the expression of Rab25 protein and clinicopathological factors of NSCLC patients(n=61)

3 讨 论

癌症的发生发展是多个促癌基因激活和抑癌基因失活的过程，寻找肿瘤相关基因并研究其作用机制，可更好地阐明肿瘤的发生发展过程，为治疗肿瘤探寻新的道路。基因Rab25位于人染色体1q22，横跨9kb，仅在胃肠黏膜、肺、肾等上皮组织中表达。Rab25蛋白为小GTP结合蛋白，在细胞内囊泡转运中起分子开关的作用，并与GTP的结合和水解相偶联[7]。目前多项研究发现，Rab25在肝癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺侵袭癌、卵巢癌等多种肿瘤中高表达，在肿瘤发生、浸润和转移中起重要作用，并与患者不良预后密切相关[8-11]。但是，在激素不敏感型乳腺癌、结直肠癌等肿瘤中，Rab25却扮演抑癌因子的角色，确切机制尚不明确[12-13]。本课题组前期研究采用基因芯片技术筛选人正常肺干细胞和肺腺癌干细胞差异表达的基因，结果显示在表达上调的11个原癌基因中Rab25上调最高，为18.1倍[14]。因此，推测Rab25可能在NSCLC中亦发挥重要作用，但目前国内外鲜有相关研究报道。

本研究结果显示，Rab25在NSCLC组织中阳性表达率明显高于癌旁组织(93.4% vs 27.5%)，差异有统计学意义(P=0.000)，可见在NSCLC中Rab25存在异常高表达，与我们前期研究结果较为一致。而且，NSCLC肿瘤体积≥4cm患者的Rab25阳性表达率明显高于体积＜4cm的NSCLC患者，差异有统计学意义(P=0.028)，推测在NSCLC中Rab25可促进肿瘤增殖，发挥促癌因子作用。已有多项体内和体外实验证实，在多种肿瘤细胞中上调Rab25表达，可使细胞群增殖和存活显著提高，采用小干扰RNA下调Rab25表达，可使细胞凋亡增加，侵袭黏附能力下降[15-17]。Cheng等[18]最新研究发现，Rab25不仅能下调凋亡蛋白BAX和BAK，激活PI3K-Akt信号通路，促进癌细胞增殖和减少凋亡，还能增加癌细胞内糖原储备，在营养缺乏的情况下可减轻细胞生物能量学压力。

此外，Rab25可通过控制囊泡运输及与整合素α5β1相互作用，加速肿瘤细胞的侵袭转移[19-20]。在人卵巢肿瘤细胞A2780中，Rab25直接作用于迁移细胞伪足顶端整合素α5β1的β亚基，增强癌细胞穿透基质的能力，促进细胞在含有纤维连接蛋白的3D基质中的侵袭转移[20]。多项临床试验[5]也证实，Rab25高表达和乳腺癌、卵巢癌等患者的低生存率和不良预后密切相关。本实验结果显示，NSCLCⅡ－Ⅲ期患者Rab25阳性表达率高于Ⅰ期患者(48.4% vs 23.3%)，差异有统计学意义(P=0.042)，可见Rab25高表达促进了NSCLC的恶性生物学行为，并且可能成为判断患者不良预后和生存期的指标之一。本实验对深入研究Rab25在NSCLC中的作用及机制，进一步发掘更多运输蛋白在肿瘤中的重要功能奠定了基础，为肿瘤治疗提供了新的思路。

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