柳跃，潘超美，赖珍珍，吴国裕，刘欣，肖斌

(广州中医药大学 中药学院，广州510006)

广东省科技厅社会发展面上项目(2008B080701030)；湛江市农业局科技项目(2005D2050006))

*

潘超美，教授，研究方向：药用植物资源的开发利用、种质资源遗传多样性研究；

E-mail：pancm@gzucm.edu.cn

毛冬青组培苗壮苗生根与炼苗移栽技术研究△

柳跃，潘超美*，赖珍珍，吴国裕，刘欣，肖斌

(广州中医药大学 中药学院，广州510006)

目的以前期诱导培养的毛冬青无菌组培苗为试材，进行壮苗生根和炼苗移栽的试验研究。方法对不同植物生长调节剂浓度配比进行选择，用正交设计法筛选出最适宜的壮苗生根培养基；对开盖时间、水培时间、保留有效叶片数及不同基质进行考察，以筛选出最佳的炼苗移栽条件。结果适宜的壮苗培养基为MS+6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1，适宜的生根培养基为1/2 MS+NAA 0.2 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1；开盖炼苗和水培练苗最适宜时间为8 d，保留叶片10片以上成活率最高，最佳的炼苗移栽基质为蛭石，成活率达87.50%。结论6-BA和NAA对壮苗有显著影响，NAA效果强于6-BA，NAA对根的诱导有显著意义；移栽成活的关键是适当地进行炼苗，蛭石良好的保水透气性和保肥能力更适于毛冬青的移栽。

毛冬青；壮苗生根；炼苗移栽

毛冬青IlexpubescensHook.etArn.为冬青科常绿灌木,主要分布于长江以南地区，为我国南方的常用中药[1]。毛冬青以干燥根入药，具有活血通络、消肿止痛、清热解毒之功效[2]。以毛冬青根提取物制成的注射液、胶囊和片剂常用于临床上心血管疾病和各种炎症的治疗，近年来随着毛冬青制剂需求量的增长，原料药材市场缺口较大。毛冬青药材主要来源于野生资源，其种子萌发率低，扦插繁殖生根较困难。目前关于毛冬青组织培养方面的研究仅见于赖珍珍等[3]发表的毛冬青的组织培养与快速繁殖的报道，本研究在其前期离体快繁丛芽成功的基础上，通过正交试验筛选出毛冬青壮苗生根所需的植物生长调节剂最佳配比，并探讨炼苗驯化的适宜条件，以期为今后毛冬青优质种苗的产业化、规模化生产以及野生转家种驯化技术提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本课题组前期以毛冬青种子无菌苗上胚轴离体快繁获得的丛芽。

1.2 方法

毛冬青壮苗、生根培养分别以MS和1/2 MS为基本培养基，按表1和表2采用L9(34)正交设计法添加不同的生长调节剂。选取健壮、无菌的试管苗，剪成约1.5 cm带茎节小苗，接种于不同配比的培养基中，在室温25±2 ℃，光照强度40 μmol·m-2·s-1，光照周期12 h·d-1条件下培养60 d。培养60 d天后，取长势良好、根系发达、高为3～5 cm的组培苗进行炼苗条件筛选，最后用蛭石、河沙、园土不同基质按不同的比例进行移栽炼苗。

表1 L9(34)壮苗试验因素水平表

表2 L9(34)生根试验因素水平表

2 结果与分析

2.1 生长调节剂对毛冬青丛芽壮苗生长的影响

通过60 d的培养后，第5号6-BA 0.3 mg·L-1+ NAA 0.5 mg·L-1和第6号6-BA 0.3 mg·L-1+ NAA 0.75 mg·L-1激素组合上的试管苗长势最好，平均增高明显，植株粗壮，叶片大而墨绿(图1-A)。添加NAA可诱导植株长出少量须根，根系短而纤细。6-BA浓度过高会抑制植株的生长，当6-BA浓度大于NAA浓度时，基部出现膨大的愈伤组织，并有侧芽长出。从直观分析法(表3)可以得出，以苗增高为参考指标，6-BA和NAA对毛冬青的壮苗均有重要影响，NAA影响作用大于6-BA，从均值可以得出6-BA最优浓度水平为0.3 mg·L-1，NAA最优浓度水平为0.75 mg·L-1。

表3 L9(34)壮苗正交试验安排与结果

对正交结果方差分析(表4)显示，NAA对毛冬青壮苗有显著性差异(P<0.05)，植物生长调节剂配比为6-BA 0.3 mg·L-1与NAA 0.5 mg·L-1或NAA 0.75 mg·L-1时均能诱导出健壮的植株，根据实际生产的节约原则，以6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1更为合适。

表4 L9(34)壮苗方差分析

*差异有统计学意义

2.2 生长调节剂对毛冬青试管苗生根的影响

将生长至3～4个节带叶的试管苗转接到正交设计不同植物生长调节剂配比的生根培养基上，1周后，基部根系开始生长，60 d后均能形成须根系，说明NAA和IBA的对毛冬青生根的诱导均有影响，从表5可见，以NAA影响效果最明显。NAA浓度在0.2mg·L-1时最为适宜，可诱导出大量须根系，浓度过高则会抑制生根并且产生多数不正常的白色气生根。当NAA为0.2 mg·L-1，IBA为0.1 mg·L-1时平均生根数达37.8条，植株根系粗壮，生长良好(图1-B、1-C)。直观分析法(表5)表明，在毛冬青生根诱导试验中，NAA对试验结果影响最大，IBA也有一定影响。均值越大，水平越优，故NAA的第二个浓度水平0.2 mg·L-1为最优，IBA的第三个浓度水平0.3 mg·L-1为最优。

表5 L9(34)生根诱导正交试验安排与结果

用方差分析法(表6)分析两种植物生长调节剂，在生根试验中，NAA对毛冬青生根诱导具有显著性差异(P<0.05)，IBA为0.1 mg·L-1时同样能诱导健壮根系。结合实际生产，生根最佳配方组合为NAA 0.2 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1。

表6 L9(34)生根方差分析

*差异有统计学意义

A：壮苗培养60d后的生长情况 B～C：生根培养60d后的生长情况 D：移栽到蛭石的试管苗图1 毛冬青壮苗生根与炼苗移栽

2.3 不同开盖炼苗时间对毛冬青移栽成活率的影响

结果表明，开盖炼苗8 d后，再进行移栽，毛冬青移栽成活率最高(图2)，此时叶片不易枯萎，整体生长良好。未经开盖炼苗的毛冬青直接移植，成活率只有43.75%，组培苗死亡过半，移栽后叶片很快出现萎蔫。随着开盖炼苗时间的延长，毛冬青组培苗的移栽成活率不断提高，超过8 d成活率反而下降，选择开盖炼苗8 d为最佳的开盖炼苗时间。

图2 不同的开盖炼苗时间对毛冬青成活率的影响

2.4 不同水培炼苗时间对毛冬青移栽成活率的影响

不同的水培时间对炼苗亦有一定的影响，它能让移栽前的小苗快速适应外界温差湿度等变化，提高抗逆能力。从图3可以看出，水培炼苗8 d后，再进行移栽，毛冬青组培苗成活率最高，移栽30d后成活率达到87.50%，植株整体生长状况良好，为最佳水培炼苗时间。试验表明，炼苗前采用水培法进行培养后移栽，成活率普遍提高，但随着水培炼苗时间的延长，毛冬青移栽成活率反而降低。

图3 不同的水培炼苗时间对毛冬青成活率的影响

2.5 保留有效叶片数对毛冬青移栽成活率的影响

从图4可以看出，移栽炼苗时保留叶片10片以上对毛冬青组培苗成活率最高，达到86.67%，整体生长状况最好，幼苗生长快，叶色深绿，根系粗壮，有新根长出。叶片低于10片以下时，幼苗光合作用能力弱，生长缓慢，自养能力不完善，导致部分苗株死亡。综合比较，炼苗时选择10片以上叶片进行移栽为最佳条件。

图4 有效叶片数对毛冬青成活率的影响

2.6 不同移栽基质对毛冬青移栽成活率的影响

移栽前的炼苗处理是为了提高植株移栽时适应外界环境的能力，而移栽基质则会直接影响组培苗的成活率和植株的生长，也是组培苗过渡到大田定植的成活关键之一。在相同的培养条件下，1号基质(蛭石∶河沙∶园土=1∶0∶0)上的组培苗成活率最高，达87.50%(表7)。幼苗根系密集，有较多新根长出，苗生长良好，叶片油亮墨绿(图1-D)。7号和10号移载成活率较高，蛭石、河砂和园土按适当的比例组合可以提高基质的保水保肥和透气的能力，提高移栽成活率。4号、8号和10号成活率较高，但整体生长状况不及1号和7号。由此可见，当蛭石在基质中占有较大比例时，可以保证小苗成活率。 3号移栽成活率最低，呈线性下降，多数小苗因根部通气不好发生腐烂枯死，少数存活苗株叶片短小，枯黄，这是由于园土虽然保湿性良好，但容易板结成块，影响通气。园土表面容易出现染菌现象，原因可能是春季炼苗湿度大，适合真菌生长。基质中掺有园土的5号、6号和9号基质也出现表面染菌现象，多数幼苗茎基部发黑，最终枯死。单组分河沙基质的2号移栽成活率亦较低，由于河沙的保湿性一般，导致植株长势矮小，叶片部分出现萎蔫现象。

表7 不同移栽基质配比对毛冬青每周成活率的影响

注：+表示苗生长一般，++ 表示苗生长较好，+++表示苗生长很好。

3 讨论

本试验考察了不同的植物生长调节剂对毛冬青离体快繁壮苗和生根的影响，研究结果表明，单独添加NAA时，在所使用的浓度范围内，植株的生长与浓度呈正相关；NAA与适当浓度的6-BA配合可以有效地促进叶片的生长，植株长势健壮，叶大色绿。6-BA浓度比例过高时，会抑制植物的顶端优势和叶的生长，同时对根的生长也有抑制作用。植物生长调节剂的种类、浓度以及配比均对植物器官形成有明显的的调控作用。在壮苗试验中，细胞分裂素与生长素的浓度比不能大于1，否则会产生膨大的愈伤组织和丛生小芽，并抑制顶芽的生长。在生根试验中，NAA和IBA都能诱导出健壮、发达的根系和长势良好的植株，且NAA对生根的促进效应优于IBA，这与同属植物冬青在生根试验中得到的结果一致[5]。在毛冬青组培苗生产过程中，NAA对根的分化和增粗生长均有明显效果。

组培苗植株幼嫩柔弱，从恒定的实验室环境过渡到变化的外界自然环境中，抗逆性差，所以移栽前需要对植株进行不同的炼苗处理，以提高植株的保水能力和自养能力[6]。开盖炼苗和水培炼苗处理，有利于诱导幼苗适应外界环境的生长能力。水培时间过长会导致根系细胞呼吸作用受到抑制，降低植株的成活率。保留一定的叶片数能提高毛冬青炼苗的成活率，有效叶片数10片以上植株光合作用能力较强，但在实验过程中需要保证环境的湿度，以免叶片蒸腾作用过强而发生死亡。适宜的炼苗条件能够大幅度提高毛冬青组培苗的移栽成活率，通过炼苗过程，可以促进叶片保护组织分化、提高气孔的闭合功能、使蒸腾作用降低，以适应外界温湿度的变化，这与前人相关的研究结果一致[7-11]。

炼苗基质的种类是影响组培苗成活率的关键因素，3种基质由于比重、结构和孔隙度的不同，具有不同的保水性和透气性。蛭石质地疏松，具有良好的保湿性，透气性和保肥能力，有助于根系细胞的呼吸和生长，避免根系发生腐败[12]，能有效地促进毛冬青幼苗的根系发育。河沙其透气性较好而保水性较差，容易造成基质缺水。园土的透气性弱，极易发生根系腐烂和植株萎蔫现象。

本试验建立了毛冬青的离体快繁技术，对毛冬青的壮苗生根及炼苗移栽的配方优化和驯化条件具有一定的指导作用，对毛冬青种质资源的可持续利用和日后组培苗的高效生产及大田育苗具有一定参考价值。

[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].第五册第十三卷.上海：上海科学技术出版社，1999：155-158.

[2] 广东省食品药品监督管理局.广东省中药材标准[S].第二册.广州：广东科技出版社.2011：77.

[3] 赖珍珍，潘超美，梁钻姬，等.毛冬青的组织培养与快速繁殖[J].植物生理学报.2010，6(8)：853-854.

[4] 梁珍海，刘根林，蒋泽平，等.大叶冬青叶外植体的愈伤组织诱导与不定芽苗再生[J].南京林业大学学报(自然科学版)，2003，27(6)：51-54.

[5] 陈家龙，王广东，郝日明.冬青的组织培养与快速繁殖技术[J].温州农业科技，2007，(4)：35-38.

[6] 陈彩霞，李玉琴，逯向东.木本植物组培苗的温室炼苗技术[J].林业实用技术,2004，(5)：22-23.

[7] 柴慈江，张磊，杨恩芹.开瓶炼苗对葡萄试管苗气孔开度及移栽的影响[J].天津农业科学，1995，1(2)：23-25.

[8] 陈惠，张海燕.植物试管苗移栽过程中气孔开度的变化研究[J].山东师范大学学报(自然科学版)，1998，13(3)：295-299.

[9] 刘小阳，柏新富，徐德聪，等.姜试管苗移栽过程中的蒸腾及光合性能变化[J].云南植物研究，2006，28(2)：199-202.

[10] 张有铎，蔡祖国，卢莉，等.开瓶炼苗对菜用大黄组培苗气孔特性的影响[J].河南农业科学，2010，(5)：83-87.

[11] 李朝周，张利平，曹孜义.葡萄试管苗炼苗过程光合特性的变化[J].甘肃农业大学学报，1995，30(4)：303-306.

[12] 李斗争，张志国.设施栽培基质研究进展[J].北方园艺，2005，(5)：7-9.

TheStudyonRapidPropagationinVitroandTransplantTechniqueofIlexpubescens

LIUYue,PANChaoMei*,LAIZhenZhen,WUGuoYu,LIUXin,XIAOBin

(SchoolofChinesePharmaceuticalScience，GuangzhouUniversityofChineseMedicine，Guangzhou510006,China)

Objective：Rapid propagation in vitro and transplant technique ofIlexpubescenas were studied with aseptic seedlings.MethodsOrthogonal design method was used to investigate the effect of combinations of different plant growth regulartors on strengthening seedling and rooting ofIlexpubescen.The effect of duration of opening vessel lid,the length of hydroponic time,the number of remained leaves and different type of transplanting stromata on survival ratio of seedlings were appraised in order to screen out the best transplant conditions.ResultsThe results showed that the suitable phytohormonic medium for strengthening seedling was MS+6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1,the fitting rooting medium was 1/2 MS+NAA 0.2 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1,The best time of opening vessel lid and the best hydroponic time were both 8 days,keeping more than 10 pieces of leaves could increase the survival rate,the best transplant stromata was vermiculite,whose survival rate was up to 87.50%.ConclusionThe research showed that both 6-BA and NAA had prominent effect on strengthening seedling,and the effect of NAA was greater than that of 6-BA.In addition,NAA revealed a better effect on the induction of rooting.The key to success of transplant was hardening of seedling.Vermiculite seemed to be more suitable for transplant due to its capacity of keeping moisture,gas permeability and fertilizer.

Ilexpubescens;Strengthen seedling and rooting;Transplant

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.04.012

2014-03-08)