毕武，周佳民，黄艳宁，曹亮，朱校奇

(湖南省农业科学院 农业生物资源利用研究所，湖南 长沙 410125)

国家公益性行业(农业)科研专项(201303117)，长沙药用植物特色产业科技示范基地(K1303011-21)

△*

朱校奇，研究员，研究方向：药用植物栽培，Tel：(0731)84692900，E-mail：zhuxiaoqi222@163.com

湖南地区玉竹根腐病病原鉴定及其生物学特性研究△

毕武，周佳民，黄艳宁，曹亮，朱校奇*

(湖南省农业科学院 农业生物资源利用研究所，湖南 长沙 410125)

目的明确导致湖南地区玉竹根腐病发生的主要病原。方法通过调查湖南玉竹主产区玉竹根腐病发生情况，对病原进行分离，并采用柯赫氏法则进行致病性测定，最后根据真菌形态和分子鉴定结果确定病原菌种属，同时对该病原菌基本的生物学特性进行了测定。结果芬芳镰刀菌Fusariumredolens为玉竹根腐病主要病原，该菌菌丝生长适宜碳源为蔗糖，氮源为牛肉膏，温度为25 ℃左右，pH为8～9。结论本研究明确了湖南玉竹主产区玉竹根腐病病原及其基本的生物学特性，不但为该病害的防控提供了依据，还可为抗病育种奠定基础。

玉竹；根腐病；病原；芬芳镰刀菌；生物学特性

玉竹Polygonatumodoratum(Mill.)Druce为百合科Liliaceae黄精属Polygonatum植物，以根状茎药用，为常用中药，《神农本草经》、《本草正义》均有记载，该药在中国已有几千年的用药历史[1-2]。玉竹又名葳蕤、萎蕤、女萎。性味归经：甘，微寒，入肺、胃经。功能与主治：养阴润燥，生津止渴。用于肺胃伤阴、燥热咳嗽、咽干口渴，内热消渴[3]。

目前，玉竹在中国大部分地区均有分布，人工栽培玉竹主要产于湖南邵东、广东连县、江苏南通、浙江东阳等19个县/市。以湖南邵东产量大、质量好，绝大部分出口外销，称“湘玉竹”[4]。

近年来，随着玉竹种植规模的逐渐扩大、种植年限的增加，全国大部分玉竹产地病虫害也越来越重，已严重影响玉竹的品质，成为玉竹生产开发的主要障碍。在邵东地区，近年来连年连片种植，行间荫蔽，导致病菌的发生与流行，尤其是引起根部染病的土传病害，逐年加重，严重影响了玉竹的产量和品质。

因此，明确玉竹根腐病的病原就显得十分迫切和必要，在此基础上了解其相关生物学特性，可为科学合理的病害防治奠定良好基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2012年5～8月间于湖南省邵东斫曹乡玉竹种植地采集发病的典型样本20株。

1.2 真菌分离

采用常规组织分离法进行真菌分离，分离到的菌株经单孢纯化后接种在PDA斜面上[5-6]，4 ℃冰箱中保存。

1.3 真菌的形态鉴定

对采集的标本描述其症状，显微镜下观察病原菌的形态特征，测定50个孢子的大小。根据症状特点、真菌的形态、大小，参照有关资料进行鉴定[7-8]。如系镰孢菌，在Booth标准条件下培养。根据培养菌的形态特征进行鉴定。

1.4 真菌的分子鉴定

1.4.1 DNA提取 将所保存的待测菌株接种到PDA平板上活化，25 ℃下培养7 d后刮取少量菌丝，液氮研磨，然后按DNA提取试剂盒(北京博迈德科技发展有限公司)上的操作说明书进行DNA提取，最后将提取出来的DNA置于-20 ℃保存。

1.4.2 扩增引物 rDNA ITS区采用通用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和 ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAGG-3′)进行PCR扩增[9]；翻译延伸因子TEF-1α区采用通用引物EF1T(5′-ATGGGAAGGAGGACAAGAC-3′)和EF2T(5′-GGA-AGTACCAGTGATCATGTT-3′)进行PCR扩增[10]。

1.4.2 PCR反应条件 PCR反应体系为：2×PCR StartMix 15 μL(以上试剂均为北京康润生物公司生产)，模板DNA 10 ng，引物(10 μmol)各1 μL，加dd H2O使总体积达到30 μL，在PCR扩增仪(Mastercycler nexus gradient，Eppendorf)上进行扩增。扩增条件：95 ℃预变性4 min，94 ℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min[9-10]。PCR产物由北京天一辉远生物公司进行序列测定。

1.4.3 序列分析与数据处理 测定的rDNA ITS序列和TEF-1α序列通过BLAST软件与GenBank 核酸数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)中的相关序列进行同源性比较。

1.5 致病性测定

根据柯赫氏法则进行测定，采用活体根部接种法结合盆栽接种法[5，10-11]。

活体根部接种法：将所保存的待测菌株接种到PDA平板上活化，25 ℃下培养7 d后，用无菌蒸馏水洗下孢子，并将孢子浓度调整到1×106个/mL。取冬季休眠期健康3年生玉竹完整根茎，用5%NaClO进行表面消毒，无菌水冲洗3次，然后在配好的孢子悬浮液中浸泡5 min，取出放入铺有2层灭菌滤纸的培养皿中，加入少量无菌水保湿，以无菌水作为对照，每个菌株接种12棵根茎，其中6棵为刺伤接种。25 ℃黑暗条件下培养。接种期间玉竹根茎为活体状态。对接种后表现根腐症状的根茎进行病原再次分离培养，观察得到的病菌是否与原接种菌株相同。

盆栽接种法 将所保存的待测菌株接种到PDA平板上活化，25 ℃下培养7d后，接入装有半盆经过湿热灭菌土壤的花盆中，拌匀。取冬季休眠期健康3年生玉竹完整根茎，用5%NaClO进行表面消毒，无菌水冲洗3次，栽入花盆中，盖上一层灭菌土。以不接菌的盆栽作为对照，接种方式分刺伤和不刺伤，每个花盆接种3棵根茎，各4次重复。其中12棵为刺伤接种。室温条件下培养。对接种后表现病害症状的植株进行病原再次分离培养，观察得到的病菌是否与原接种菌株相同。

1.6 生物学特性测定

将供试菌株在PDA平板上培养5 d后，用内径为5 mm的打孔器在菌落边缘切取菌丝圆片并置于不同的条件下培养，分别进行以下处理[12-13]。

1.6.1 不同温度条件下菌丝生长 采用PDA平板测定。温度范围为5～40 ℃，梯度为5 ℃。每处理重复4次。恒温下培养6 d后测量菌落两个相互垂直生长直径，取其平均值。

1.6.2 不同pH条件下菌丝生长 采用PDA平板测定。pH范围为3.0～11.0，梯度为1.0，每处理重复4次。用1 mol·L-1的HCl或1 mol·L-1的NaOH调节pH。测定方法与温度的测定方法相同。

1.6.3 不同碳源条件下菌丝生长 以查氏培养基为基础培养基，分别用不同类型的糖(葡萄糖、蔗糖、甘油、D-麦芽糖、D-果糖、D-半乳糖、乳糖、可溶性淀粉)来等量取代基础培养基内的碳源后形成供试培养基，每处理重复4 次。6 d后测量菌落生长直径，取其平均值。

1.6.4 不同氮源条件下菌丝生长 以查氏培养基为基础培养基，分别用NH4+态氮[NH4Cl、(NH4)4SO4]、NO3-态氮(KNO3，NH4NO3)和有机氮(甘氨酸、L-苯丙氨酸、L-羟基脯氨酸、牛肉膏、蛋白胨)来等量取代基础培养基内的氮源后形成供试培养基。测定方法与碳源的测定方法相同。

图1 菌落

图2 厚垣孢子(40×)

图3 产孢结构(40×)

2 结果与分析

2.1真菌形态学及分子鉴定结果

从玉竹病根上分得真菌73株，对这些真菌的鉴定结果显示，玉竹病根上真菌主要类群为Fusariumredolens，F.oxysporium，F.nematophilum，F.solani，Rhizopycnisvagum。

2.2 致病性测定结果

对分离得到的真菌进行了致病性测定，根据离体接种结果和盆栽实验显示，确定编号为YG1的真菌为玉竹根腐病的主要病原，在两种测定条件下都能引起玉竹的病害，其中刺伤接种发病程度更严重。

2.3 病原菌鉴定结果

形态鉴定：培养物在PSA培养基上呈淡黄色，绒毛状，菌丝体白色。小型分生孢子椭圆形或腊肠形，着生于短的侧生瓶状小梗上，数量多，大小为2-8～1-4 μm。大型分生孢子镰刀形，倾向于“马特”型，数量稀少。厚垣孢子间生或顶生，单独或呈链状，光滑或粗糙。

分子鉴定：根据YG1菌ITS序列和TEF-1α序列比对结果，与该菌ITS序列序列相似度最高的为F.redolens(100%)，F.oxysporium(99%)和F.con-centricum(98%)与TEF-1α序列相似度最高的为F.redolens(100%)，两序列的GenBank登录号分别为KF055838和KF055839。

综合形态鉴定和分子鉴定结果，确定该菌为Fusariumredolens。

2.4 生物学特性测定结果

2.4.1 不同碳源条件下菌丝生长 菌落在所测试碳源(包括单糖，双糖，多糖)中均能生长，在葡萄糖和蔗糖上生长最好，其中以蔗糖为最佳碳源。

2.4.2 不同氮源条件下菌丝生长 菌落在三种氮源条件下均能生长，其中，在NO3-态氮和有机氮上生长良好，NH4+态氮上生长稍差。在以牛肉膏为氮源的培养基上长势最佳。

2.4.3 不同pH条件下菌丝生长 菌落在pH 3～11范围内都能生长，其中以pH 5～10之间生长良好，pH 8～9范围内为其生长的最适pH。由此可见，该菌在中性和偏碱性的条件生长最好。

图4 不同碳源下菌丝生长

图5 不同氮源下菌丝生长

图6 不同pH条件下菌丝生长

图7 不同温度下菌丝生长

2.4.4 不同温度条件下菌丝生长 菌落在5 ℃和40 ℃均不能生长，25 ℃左右为其生长的最佳温度。菌落在10～35 ℃都能生长，10～35 ℃范围内生长直径随温度升高而增大，但温度过高或过低均对菌丝生长不利。

3 讨论

目前仅贵州、辽宁、湖南等玉竹主产地初步报道了玉竹的病害及其防治情况，贵州地区主要以叶斑病，茎腐病，锈病等真菌性病害为主，但关于病原的详细情况未见报道[14]；辽宁地区主要以褐斑病、紫轮病、锈病等真菌性病害为主，但仅对褐斑病病原锐顶镰孢菌F.acuminatum的生物学特性和防治方式进行了较为详细地探讨[13，15-16]。湖南玉竹主产区病原的报道很少，仅有人初步报道了病害的调查结果[4，17-18]，认为根腐病为主要病害，但未见对其病原的详细研究。

吕劲锋等[19]曾报道广东地区玉竹主要病原为腐皮镰刀根生专化型F.solani(Mart.)Sacc.f.sp.radicicola(Wr.)Snyd.&Hans.，有报道认为湖南邵东玉竹根腐病病原也为该菌[4，17-18]。但本研究的结果表明：湖南邵东玉竹根腐病的主要病原为芬芳镰刀菌F.redolens。出现这种差异的原因可能是玉竹根腐病由几种不同病原共同侵染造成，由于采样时间和采样地点的差异，导致分离得到的优势菌株差异较大。具体原因因为前人研究资料缺乏，暂时难有定论，还需要进一步深入的研究和更多的数据支持。

芬芳镰刀菌F.redolens能引起作物发生病害的报道近年来逐渐增多[20-22]，但未见引起玉竹病害的报道。F.redolens是一类形态比较特殊的镰刀菌，其分类地位在不同的分类系统中并不相同。它与尖孢镰刀菌F.oxysporium都属于镰刀菌属美丽组，且形态极其相似。在美丽组中，所有分类系统中都包含尖孢镰刀菌F.oxysporium。而芬芳镰刀菌F.redolens.，在Booth[7]系统中将其作为1个变种(尖孢镰刀菌芬芳变种)进行描述，没有将F.redolens独立为种；在John F.Leslie等[8]的系统中则单独作为1个种；在Snyder & Hansen和Nelson，Toussoun & Marasas系统中没有单独划分为1个种，而是归在F.oxysporum种内[23]。鉴于镰刀菌属真菌形态的复杂多变性及F.redolens与F.oxysporium的高度相似性，本实验采用了目前应用较多的TEF-1α序列的分子鉴定方法进行鉴定[24-27]，同时也比较了ITS序列测定的鉴定方法，结果表明TEF-1α序列测定的鉴定方法可以达到鉴定的目的。

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BiologicalCharacterizationandPathogenIdentificationofPolygonatumodoratumRootRotinHunan，China

BIwu，ZHOUJiaming，HUANGYanning，CAOliang，ZHUXiaoqi*

(InstituteofAgriculturalandBiologicalResourcesUtilization，HunanAcademyofAgriculturalSciences，Changsha410125，China)

Objective：To confirm the pathogen ofPolygonatumodoratumroot rot in Hunan，China.MethodsIn this study，Fungi was isolated by common method，Pathogenicity was tested according to koch’s postulates，and identification of the fungi were carried out by the method of morphology and molecular biology.The effect of temperature，pH，carbon and nitrogen sources on colony growth was also assessed by the growth rate.ResultsFusariumredolenswas identified as the pathogen ofPolygonatumodoratum.The results showed that the optimum temperature was about 25 ℃，and the optimum pH for hyphae growth was 8-9.The growth of colony was the best with sucrose as the carbon source，and beef extract as the nitrogen source.ConclusionThis study confirmed the pathogen ofPolygonatumodoratumroot rot in Hunan and its biological characterization，which can provide evidence for prevention and treatment of this disease，also benefit to the breeding and disease resistance ofPolygonatumodoratum.

Polygonatumodoratum；Root rot；Pathogen；Fusariumredolens；Biological characterization

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.02.010

2013-05-28)