马首智，张涛，翟琳辉，孙玉琳，徐平，赵晓航,4

1 北京协和医学院 中国医学科学院肿瘤研究所 分子肿瘤学国家重点实验室，北京 100021

2 军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850

3 北京蛋白质组研究中心，北京 102206

4 海军总医院基础医学研究中心，北京 100048

质谱分析前蛋白样品预处理是蛋白质组学研究的关键环节之一。目前普遍认为，含高浓度去垢剂的缓冲液有助于充分抽提蛋白，含有4% SDS、0.1 mol/L DTT去垢剂的缓冲液的使用越来越广泛。但高浓度去垢剂会对下游的蛋白定量、酶解等步骤造成干扰，常用的蛋白定量方法，如BCA (Bcinchoninic acid)法和Bradford法 (又名考马斯亮蓝法、CBB法)都不适用。甚至可用于双向电泳蛋白样品预处理的 2-D quant 试剂盒[1]都无法耐受 4%的 SDS。因此，急需发展耐受高浓度去垢剂的蛋白样品预处理方法。

对于含高浓度去垢剂的蛋白样品，主要有两种预处理方法，包括超滤辅助样品制备 (Filter aided sample preparation methods, FASP)[2-6]和短胶法 (Short gel)[7]。与其他方法相比，短胶法在分析微量蛋白样品时更有优势[8]。与常规SDS-PAGE分析不同，短胶法只进行短距离 (2–25 mm)凝胶电泳，减弱样品蛋白的稀释程度。

本实验室前期研究发现，短胶法同样可以用于蛋白定量[9]。但短胶法定量的线性范围还不清楚。本研究分析了短胶法定量的线性范围，并将短胶法用于质谱前蛋白样品预处理。结果表明，短胶法在1–8 μg BSA范围内有极高线性度，且定量重复性较好，与下游技术兼容，定量后的蛋白可直接进行蛋白质组学分析，是一种值得推广的蛋白样品预处理方法。

1 材料与方法

1.1 材料

敲降靶蛋白的食管癌 KYSE140细胞由本室构建，培养于RPMI 1640培养基中，含10%胎牛血清和1%青链霉素，于37 ℃、含5%二氧化碳的孵箱中培养。蛋白提取缓冲液为100 mmol/L Tris，pH 7.5；4% SDS；100 mmol/L DTT和蛋白酶抑制剂等。转膜液为25 mmol/L Tris；195 mmol/L甘氨酸和20%甲醇。蛋白抽提液为5%甲酸和50%乙腈。鸡尾酒式蛋白酶抑制剂购自美国 Roche公司。胰蛋白酶购自美国 Promega公司。牛血清白蛋白 (Bovine serum albumin, BSA)标准品和小鼠抗人β-actin抗体购自美国Sigma公司。辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗购自中杉金桥生物技术公司。ECL发光试剂盒购自普利莱公司。UPLC液相色谱系统为美国 Agilent公司产品，LTQ-Obitrap Velos质谱系统为美国Thermo Fisher公司产品。LAS 4000图像采集仪为日本富士公司产品。

1.2 蛋白提取

对照细胞和siRNA处理的细胞培养至90%汇合度，将细胞置于冰上，加预冷的磷酸盐缓冲液洗两遍。加入蛋白提取缓冲液，用细胞刮刀将细胞刮下，冰上孵育30 min。超声破碎后12 000 r/min、4 ℃离心15 min。上清分装后储存于–80 ℃冰箱备用。

1.3 短胶法蛋白定量

配制不同浓度的BSA标准蛋白并准备适当体积的待测样品蛋白。加入 SDS-PAGE上样缓冲液后，80 ℃加热10 min。室温高速离心5 min，保留上清。制备浓缩胶和分离胶，上样后恒压80 V电泳至溴酚蓝前沿进入分离胶2 mm即停止电泳。加入考马斯亮蓝G250进行凝胶染色，脱色至凝胶背景清晰。使用图像采集仪扫描凝胶图相，并用Scion image软件分析图像灰度值。根据标准蛋白的灰度值建立标准曲线，根据样品蛋白的灰度值计算待测蛋白含量。

1.4 常规SDS-PAGE凝胶法蛋白定量

制备浓缩胶和分离胶，蛋白样品上样后80 V恒压电泳至溴酚蓝前沿出分离胶后停止。考马斯亮蓝G250凝胶染色，脱色至凝胶背景清晰。使用图像采集仪扫描凝胶图相，并采用Scion image软件进行灰度值分析。

1.5 蛋白印迹定量

采用长胶法分离蛋白，电泳后的凝胶浸泡在转膜液中平衡。安装滤纸、PVDF膜、凝胶等转膜三明治，用玻璃棒去除气泡。4 ℃冷室中110 V恒压电转1 h。含有蛋白信息的PVDF膜浸泡于10%牛奶中室温封闭1 h后，加入1∶5 000稀释的β-actin抗体，4 ℃孵育过夜。洗膜后加1∶3 000稀释的二抗，室温孵育1 h。洗膜后加入ECL发光液，LAS4000图像采集仪中采集图像。

1.6 胶内酶解

短胶电泳后对凝胶染色，切取蛋白条带。将蛋白条带切为小块，加入脱色液脱色至无色后加入乙腈脱水并旋转蒸发干燥。加入酶解缓冲液，37 ℃避光孵育12 h。蛋白消化结束后加入蛋白抽提液抽提，旋转蒸发干燥后的多肽储存于–80 ℃冰箱备用。

1.7 LC-MS/MS

首先配制流动相，流动相A为2%乙腈溶于98%超纯水，另外添加0.1%甲酸；流动相B为2%超纯水溶于98%乙腈，另外添加0.1%甲酸。酶解后的多肽溶于100%的流动相A，自动上样，梯度洗脱。液相梯度设定为在30 min内逐渐由100%的流动相 A过渡到100%的流动相B。质谱条件设定为：扫描质荷比400–1 800的离子，喷雾电压设定为2 000 V，选取一级质谱中最高的10个离子进行HCD碎裂并进行二级质谱扫描，一级质谱分辨率为 30 000，二级质谱分辨率为7 500，动态排除时间为45 s。动态排除窗口为正负 0.005 Da。每个多肽峰进行一次二级质谱扫描。

2 结果与分析

2.1 短胶法分析标准样品蛋白

BSA标准蛋白短胶电泳结果表明，随着蛋白含量升高，标准蛋白染色深度也逐渐加深。线性回归分析表明在0.5–16 μg BSA范围内R2达到 0.983，与我们的前期结果一致[9]。其中，绝对线性范围大约为 1–8 μg BSA，R2达到0.999，高于或低于这一范围线性度都会降低(图 1)。

2.2 短胶法测定样本蛋白含量

用短胶法基于建立的BSA标准曲线，测定两种待测样品，即siRNA处理细胞和对照RNA处理细胞的蛋白含量，计算 3个样品蛋白的上样量均为1.47 μg，在短胶法定量的线性范围内，可使用短胶法进行定量 (图 2)。重复上样的蛋白样品含量无差异，说明短胶法的重复性较好。

使用蛋白印迹法对短胶法测定的蛋白浓度进行分析，结果表明，免疫印迹与短胶法测定的结果不一致。蛋白印迹方法测定的蛋白样品中，两个siRNA处理后的管家蛋白含量偏高 (图2)。

图1 BSA标准蛋白短胶电泳分析Fig. 1 Short gel analysis of BSA protein. (A)Shot gel electrophoresis of BSA. From 1 to 11 wells, the amount of BSA was 12, 8, 6, 4, 3, 2, 1.5, 1, 0.75 and 0.5 μg per well respectively. (B)Relationship between BSA amount(0.5–16 μg)and band intensity. (C)Relationship between BSA amount (1–8 μg)and band intensity.

2.3 常规SDS-PAGE分析样本蛋白

为了分析导致两种定量方法差异的原因，采用常规 SDS-PAGE凝胶电泳分析了对照蛋白和siRNA处理后蛋白表达模式 (图3)。结果显示，对照蛋白与siRNA处理蛋白表达模式明显不同。对照蛋白在50 kDa左右有明显染色加深的条带，这两个蛋白的表达水平接近β-actin等内参蛋白，而这两个条带在siRNA处理的蛋白中消失了。

2.4 LC-MS/MS分析样本蛋白

短胶定量后的蛋白采用胶内酶解法消化并进行质谱分析 (图 4)。结果显示，样本质谱信号在 1E8左右，质谱信号较好。三个样本的峰形不同，对照样本最高峰的信号低于siRNA处理样本，但对照细胞中高强度峰的数量多于siRNA处理细胞。说明对照样品高丰度蛋白数量较多，但每个蛋白的含量较少，与常规SDS-PAGE法分析结果一致。

图3 蛋白样品常规SDS-PAGE凝胶电泳分析Fig. 3 Samples analyzed by regular SDS-PAGE. Line 2 was loaded control protein, line 3 and 4 were loaded siRNA treated proteins as the same amounts. Line 1 was protein molecular weight marker. The band intensities were included controls (5)and siRNA treated proteins (6 and 7, two repeats). NL: normalized protein levels.

图4 样品蛋白的LC-MS/MS法分析Fig. 4 LC-MS/MS analysis of peptides of samples.Peptides derived from control protein (1), siRNA treated proteins (2 and 3, two repeats); NL: normalized protein levels.

3 讨论

蛋白质预处理是蛋白质组学研究的重要技术。使用较高浓度的去垢剂和还原剂可以更有效地提取蛋白[10]。如本研究中使用的蛋白提取缓冲液含有4%的SDS和100 mmol/L的DTT，目前被国内外主流蛋白质组学实验室广泛使用[11-15]。标准的FASP法对含这种缓冲液的样品酶解后进行多肽水平定量。但由于现有的蛋白定量方法对高浓度去垢剂的兼容性问题，目前还没有很好的方法进行蛋白水平的定量。

我们的结果表明，使用BSA作为标准蛋白，短胶法定量的理论线性度可以达到0.999，当样品蛋白在这个浓度范围内时，即可使用短胶法进行蛋白含量测定。但这种高线性度只存在于1–8 μg 标准蛋白BSA的条件下，当BSA的含量高于或低于这个范围时，短胶法定量的线性度会发生偏差。BSA是被各种定量方法广泛使用的蛋白标准品，但蛋白质组分析的样品复杂度很高，部分蛋白性质可能与BSA有差异，可能导致定量结果出现偏差。所有的定量方法都有其线性区间。如 Bradford法按照使用的试剂不同，线性区间分别在 10−100 μg 或 1−10 μg 之间[16]。短胶法定量蛋白的线性区间在1−8 μg间，需要的蛋白量较少，与通常条件下蛋白提取量一致，而且避免了去垢剂、还原剂等杂质的干扰，更适用于蛋白定量分析。

最近，曹嵩等对进入浓缩胶中的蛋白进行考马斯亮蓝凝胶染色后使用近红外成像进行定量，发现在 1−10 μg范围内线性度最高可达0.993[17]。与这种方法相比，短胶法在线性范围大致相当的情况下，线性度更高，不需要大型仪器。而且定量的蛋白可以直接进行后续胶内酶解和质谱分析，节省样品。

蛋白印迹也是常用的蛋白相对定量方法之一。这种方法首先采用SDS-PAGE分离蛋白，分离后的蛋白转印到膜上，并与带标记的抗体共孵育，采用化学发光法检测蛋白含量[18]。由于这种方法在第一步也采用SDS-PAGE，所以也不容易受到样品中去垢剂等杂质的影响。但蛋白印迹的方法通常需要选用一两个内参蛋白作为上样量的对照。在内参蛋白的选择中可能带来人为因素的影响。在一些条件下，内参蛋白的含量会发生变化，与总蛋白的含量变化并不一致。例如，在本研究中，siRNA处理的细胞中有两个高丰度蛋白表达下降。由于这两个高丰度蛋白的含量减少，间接提高了β-actin在对照细胞蛋白中所占的比例。从而使总蛋白含量相同的情况下，β-actin的含量升高。这种情况下，使用蛋白印迹法测定高丰度蛋白含量并作为内参会导致结果出现偏差。使用短胶定量可能是一个更好的选择，因为短胶定量时所有蛋白都混合在一起进行染色和分析，单个蛋白表达量的变化并不会影响总蛋白定量的准确性。

在基于凝胶的蛋白质组学研究中，双向电泳[19]与常规SDS-PAGE凝胶电泳常用于蛋白质分析步骤中。而蛋白分子在长距离电泳时，蛋白分子迁移率与实际的分子量并非完全一致[20]。长距离电泳时，不同的蛋白彼此分开，灵敏度下降，而且不同蛋白对考马斯亮蓝染料的响应也不同[21]。为了达到好的显色效果，需要的蛋白量也大大增加，也更容易引入人为干扰，不适合作为蛋白质样品预处理的方法。

短胶法处理的蛋白可以有效地进行酶解并进行质谱分析[22-24]。常用的酶解方法是胶内酶解[25]，胶内酶解后再抽提多肽进行质谱分析。本研究中短胶浓缩的蛋白经过胰蛋白酶酶解后，使用LC-MS/MS进行半定量分析，质谱结果显示，质谱峰的信号较好，达到 1E8水平，提示样本蛋白得到了充分的消化和抽提。提示短胶法分析的蛋白可以方便地用于下游蛋白质组学研究。siRNA处理的蛋白单个峰的信号强度更高，但峰的数量更少。说明由于对照细胞中存在高丰度蛋白，对其他蛋白产生稀释作用，短胶法测定的蛋白含量更接近真实情况。

本研究分析了短胶定量的线性范围，并使用短胶法进行蛋白定量和质谱前样品预处理。结果表明短胶法是一种准确、可靠的蛋白质预处理方法，可以与高浓度去垢剂缓冲液相兼容，也不容易受蛋白表达差异的影响。短胶法可以同时完成蛋白定量、胶内酶解及后续的质谱鉴定等步骤，可以方便地用于蛋白质组学研究，值得推广。

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