朱锋钊　杜秀园　高俊波　李秀富

摘要：通过菌株分离培养、生化鉴定分析了贵州省铜仁地区各屠宰场收集的150份猪扁桃体样本，并用PCR方法对猪链球菌2型的主要致病毒力因子进行了检测。结果表明，150例样本中猪链球菌2型带菌率达到41.3%，其中屠宰场3的检出率较高，mrp、epf片段与阳性对照相关基因的同源性达到100%，屠宰场3的所有样本mrp、epf毒力因子均表现为阳性。说明该地区猪群猪链球菌2型携带率较高， mrp、epf毒性因子阳性表现型与疫病的流行可能存在一定的关联性。

关键词：猪链球菌；多重PCR；分子流行病学；贵州铜仁

中图分类号：S858.28 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2014）08-0011-02

猪链球菌是一种重要的人畜共患病原菌，通常存在于猪的上呼吸道。其中以猪链球菌2型致病性最强，可以导致断奶猪仔发生脑膜炎、关节炎、败血症等疾病，并可能造成人类感染致死[1，2]。随着我国养猪业的不断发展，猪链球菌的发病率不断升高，对该产业造成了极大的经济损失，相关从业人员的健康安全也受到极大威胁。本研究对贵州省铜仁地区的猪群猪链球菌2型进行了分子流行病学分析，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料采集和菌株培养

从贵州省铜仁地区各屠宰场收集来源明确的猪扁桃体共计150份。将各个扁桃体样品培养分离得到单个菌落，接种于马丁肉汤中（葡萄糖含量0.2%、小牛血清1%），于37.5 ℃下培养20 h。

1.2 菌株鉴定

对可疑菌落革兰染色后进行镜检，对于确定为革兰氏阳性链球菌的菌落进行过氧化氢酶实验，结果为阴性者初步确定为猪链球菌2型，进行进一步的生化鉴定：将确定菌落分别接种于5%蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、乳糖、D-核糖等培养基中，24 h后观察记录并分检出为猪链球菌2型的菌株，用于后续试验。

1.3 DNA提取

取细菌培养物1.5 mL，10 000r/min离心1 min，将沉淀物通过567μLTE缓冲液进行重悬，加入10%SDS30 μL、20mg/mL蛋白酶K3 μL，在37 ℃下水浴60 min；然后加入5mol/L NaCl溶液100μL、CTAB/NaCl溶液80μL，在65℃下水浴10 min。使用24：1的氯仿-异戊醇溶液进行抽提，然后用25：24：1的酚-氯仿-异戊醇溶液再次抽提，最后使用等体积异丙醇对核酸进行沉淀。沉淀物用70%的乙醇清洗两次，后溶于20μL双蒸水中备用。

1.4 分型PCR扩增和毒力因子检测

对菌株DNA的cps2J、mrp、epf基因片段进行PCR扩增。在95 ℃下进行5 min预变性，后在95 ℃下变性40 s（退火时间和退火温度等见表1）。其后在72 ℃下延伸30 s，循环30次后同温度下再延伸10 min。取8μL的扩增产物，在130 V电压下于1.5%琼脂凝胶中进行电泳。后取条带清晰的扩增

摘要：通过菌株分离培养、生化鉴定分析了贵州省铜仁地区各屠宰场收集的150份猪扁桃体样本，并用PCR方法对猪链球菌2型的主要致病毒力因子进行了检测。结果表明，150例样本中猪链球菌2型带菌率达到41.3%，其中屠宰场3的检出率较高，mrp、epf片段与阳性对照相关基因的同源性达到100%，屠宰场3的所有样本mrp、epf毒力因子均表现为阳性。说明该地区猪群猪链球菌2型携带率较高， mrp、epf毒性因子阳性表现型与疫病的流行可能存在一定的关联性。

关键词：猪链球菌；多重PCR；分子流行病学；贵州铜仁

中图分类号：S858.28 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2014）08-0011-02

猪链球菌是一种重要的人畜共患病原菌，通常存在于猪的上呼吸道。其中以猪链球菌2型致病性最强，可以导致断奶猪仔发生脑膜炎、关节炎、败血症等疾病，并可能造成人类感染致死[1，2]。随着我国养猪业的不断发展，猪链球菌的发病率不断升高，对该产业造成了极大的经济损失，相关从业人员的健康安全也受到极大威胁。本研究对贵州省铜仁地区的猪群猪链球菌2型进行了分子流行病学分析，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料采集和菌株培养

从贵州省铜仁地区各屠宰场收集来源明确的猪扁桃体共计150份。将各个扁桃体样品培养分离得到单个菌落，接种于马丁肉汤中（葡萄糖含量0.2%、小牛血清1%），于37.5 ℃下培养20 h。

1.2 菌株鉴定

对可疑菌落革兰染色后进行镜检，对于确定为革兰氏阳性链球菌的菌落进行过氧化氢酶实验，结果为阴性者初步确定为猪链球菌2型，进行进一步的生化鉴定：将确定菌落分别接种于5%蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、乳糖、D-核糖等培养基中，24 h后观察记录并分检出为猪链球菌2型的菌株，用于后续试验。

1.3 DNA提取

取细菌培养物1.5 mL，10 000r/min离心1 min，将沉淀物通过567μLTE缓冲液进行重悬，加入10%SDS30 μL、20mg/mL蛋白酶K3 μL，在37 ℃下水浴60 min；然后加入5mol/L NaCl溶液100μL、CTAB/NaCl溶液80μL，在65℃下水浴10 min。使用24：1的氯仿-异戊醇溶液进行抽提，然后用25：24：1的酚-氯仿-异戊醇溶液再次抽提，最后使用等体积异丙醇对核酸进行沉淀。沉淀物用70%的乙醇清洗两次，后溶于20μL双蒸水中备用。

1.4 分型PCR扩增和毒力因子检测

对菌株DNA的cps2J、mrp、epf基因片段进行PCR扩增。在95 ℃下进行5 min预变性，后在95 ℃下变性40 s（退火时间和退火温度等见表1）。其后在72 ℃下延伸30 s，循环30次后同温度下再延伸10 min。取8μL的扩增产物，在130 V电压下于1.5%琼脂凝胶中进行电泳。后取条带清晰的扩增

摘要：通过菌株分离培养、生化鉴定分析了贵州省铜仁地区各屠宰场收集的150份猪扁桃体样本，并用PCR方法对猪链球菌2型的主要致病毒力因子进行了检测。结果表明，150例样本中猪链球菌2型带菌率达到41.3%，其中屠宰场3的检出率较高，mrp、epf片段与阳性对照相关基因的同源性达到100%，屠宰场3的所有样本mrp、epf毒力因子均表现为阳性。说明该地区猪群猪链球菌2型携带率较高， mrp、epf毒性因子阳性表现型与疫病的流行可能存在一定的关联性。

关键词：猪链球菌；多重PCR；分子流行病学；贵州铜仁

中图分类号：S858.28 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2014）08-0011-02

猪链球菌是一种重要的人畜共患病原菌，通常存在于猪的上呼吸道。其中以猪链球菌2型致病性最强，可以导致断奶猪仔发生脑膜炎、关节炎、败血症等疾病，并可能造成人类感染致死[1，2]。随着我国养猪业的不断发展，猪链球菌的发病率不断升高，对该产业造成了极大的经济损失，相关从业人员的健康安全也受到极大威胁。本研究对贵州省铜仁地区的猪群猪链球菌2型进行了分子流行病学分析，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料采集和菌株培养

从贵州省铜仁地区各屠宰场收集来源明确的猪扁桃体共计150份。将各个扁桃体样品培养分离得到单个菌落，接种于马丁肉汤中（葡萄糖含量0.2%、小牛血清1%），于37.5 ℃下培养20 h。

1.2 菌株鉴定

对可疑菌落革兰染色后进行镜检，对于确定为革兰氏阳性链球菌的菌落进行过氧化氢酶实验，结果为阴性者初步确定为猪链球菌2型，进行进一步的生化鉴定：将确定菌落分别接种于5%蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、乳糖、D-核糖等培养基中，24 h后观察记录并分检出为猪链球菌2型的菌株，用于后续试验。

1.3 DNA提取

取细菌培养物1.5 mL，10 000r/min离心1 min，将沉淀物通过567μLTE缓冲液进行重悬，加入10%SDS30 μL、20mg/mL蛋白酶K3 μL，在37 ℃下水浴60 min；然后加入5mol/L NaCl溶液100μL、CTAB/NaCl溶液80μL，在65℃下水浴10 min。使用24：1的氯仿-异戊醇溶液进行抽提，然后用25：24：1的酚-氯仿-异戊醇溶液再次抽提，最后使用等体积异丙醇对核酸进行沉淀。沉淀物用70%的乙醇清洗两次，后溶于20μL双蒸水中备用。

1.4 分型PCR扩增和毒力因子检测

对菌株DNA的cps2J、mrp、epf基因片段进行PCR扩增。在95 ℃下进行5 min预变性，后在95 ℃下变性40 s（退火时间和退火温度等见表1）。其后在72 ℃下延伸30 s，循环30次后同温度下再延伸10 min。取8μL的扩增产物，在130 V电压下于1.5%琼脂凝胶中进行电泳。后取条带清晰的扩增