王加付，彭 绍，李兰杰，杨 洁，孙 婷，李绪文，金永日，时晓磊，3

（1.吉林大学 化学学院，长春130012；2.黑龙江烟草有限责任公司，哈尔滨150001；3.吉林大学 军需科技学院，长春130062）

珠子参为五加科植物珠子参（Panax japonicus C.A.Mey.var.Major（Burk.）C.Y.Wu et K.M.Feng）的干燥根状茎，具有补肺、养阴、活络和止血的作用，用于治疗气阴两虚、烦热口渴、虚劳咳嗽、跌扑损伤、关节疼痛、咳血、吐血和外伤出血等症.珠子参广泛分布于云南、贵州、湖北和四川等地［1］，生长于阴湿的针阔叶林、阔叶灌木、竹叶林以及杂灌丛中.目前，珠子参根茎的化学成分［2－5］和药理作用［6－9］研究较多，其化学成分测定［10－11］主要集中在质量浓度较大的皂苷竹节参皂苷Ⅳa和竹节参皂苷Ⅴ.本文采用高效液相色谱蒸发光散射法（HPLC－ELSD）测定珠子参根茎中新化合物24（R）－珠子参苷 R1的质量比［12］.

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

珠子参分别购于云南省昆明市和河北省安国市，经吉林大学药学院张静敏教授鉴定为珠子参的干燥根茎；实验用水为二次蒸馏水；甲醇为色谱纯；化合物24（R）－珠子参苷R1对照品自制，经质谱（MS）、红外光谱（IR）、核磁共振氢谱（1H NMR）和核磁共振碳谱（13C NMR）等方法表征样品结构，按HPLC－ELSD色谱条件归一化测定样品的质量分数为98.85%，其化学结构如图1所示.

图1 化合物24（R）－珠子参苷R1的结构式Fig.1 Chemical structure of 24（R）－majoroside R1

1.2 仪 器

Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Alltech 2000型蒸发光散射检验器（美国Alltech公司）；RE－201C型旋转蒸发仪（巩义市英峪予华仪器厂）；Mettlertoledo AG135型电子天平（德国Startorius YDO－OIR公司）；KQ－250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器公司）.

1.3 对照品的分离纯化

将珠子参根茎80%的乙醇粗提取物（约1.4kg）用洗脱剂V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）∶V（水）＝20∶1∶0.05进行硅胶柱层析.经薄层色谱（TLC）检测可得A，B，C，D 4个极性不同的部分.将B部分用洗脱剂V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）∶V（水）＝10∶1∶0.05进一步硅胶柱纯化、合并并浓缩，得到B1和B2两部分.将B1部分用V（甲醇）∶V（水）＝1.5的溶剂进行ODS柱层析，分离得到对照品70mg.

1.4 对照品溶液的配制

称量对照品约10.12mg，置于10.00mL容量瓶中，以甲醇溶解、定容，得1.00mg／mL对照品储备液.将2.0mL储备液置于10.00mL容量瓶中，用甲醇定容，得0.2mg／mL对照品溶液.

1.5 供试品溶液的制备

将干燥的珠子参粉碎，过60目筛，精密称取2.0g，用16mL甲醇作为提取溶剂，连续回流3次，回流时间依次为1.5，1.0，1.0h，合并提取液并用旋转蒸发仪蒸干，以甲醇溶解，并定容至10.00mL，过0.22μm有机滤膜，取续滤液.

1.6 色谱条件

Aglilent Zorbax SB－C18（ODS，4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；流动相为甲醇和水，等度洗脱，体积比为58∶42；流速为1.0mL／min；柱温为25℃；载气压力为1.94×105Pa；漂移管温度为85℃；撞击器关闭；进样量为20μL.将对照品溶液（质量浓度为0.2mg／mL）和供试品溶液各20μL置于高效液相色谱仪进行测定.

2 条件优化

2.1 ELSD条件选择

经紫外光谱测定，24（R）－珠子参苷R1在200～400nm无吸收，因此选择ELSD作为检测器.对ELSD的检测条件进行优化，确定其条件为：载气压力1.94×105Pa；漂移管温度85℃；撞击器关闭.

2.2 流动相选择

采用不同体积比的甲醇和水及乙腈和水作为流动相，通过比较色谱可见：采用乙腈和水作为流动相，待测化合物与样品中的其他化合物无法达到基线分离；采用V（甲醇）∶V（水）＝58∶42作为流动相可使混合物达到较好的分离效果（分离度＞1.5），且保留时间为14.2min，因此采用V（甲醇）∶V（水）＝58∶42作为流动相.

2.3 提取条件的选择

2.3.1 提取溶剂选择 将干燥的珠子参粉碎，过60目筛，称取2.0g，分别选乙酸乙酯、乙醇、体积分数为80%的乙醇及甲醇为提取溶剂，连续回流3次，合并、浓缩提取液，置于10.00mL容量瓶中，分别用色谱甲醇溶解、定容，过0.22μm有机滤膜，取20μL续滤液置于高效液相色谱仪进行测定，结果列于表1.由表1可见，甲醇的提取效率最高，乙酸乙酯的提取效率最低，因此选择甲醇作为提取溶剂.

表1 不同提取溶剂所得24（R）－珠子参苷R1的峰面积Table 1 Peak areas of 24（R）－majoroside R1extracted by different extraction solvents

2.3.2 提取溶剂用量选择 将干燥的珠子参粉碎，过60目筛，精密称取2.0g，将甲醇作为提取溶剂，考察每次提取用量为12，16，20mL时对待测物峰面积的影响，通过加热回流的方式提取3次，分别用色谱甲醇定容至10.00mL，过0.22μm有机滤膜，取20μL续滤液置于高效液相色谱仪测定.结果列于表2.由表2可见，当甲醇用量为16mL时，所得待测物的峰面积较大，因此甲醇的用量为16mL.

表2 提取溶剂不同用量所得24（R）－珠子参苷R1的峰面积Table 2 Peak area of 24（R）－majoroside R1extracted at different solvent volumes

2.3.3 提取次数的确定 将2.3.2中提取过3次的样品，继续提取1h，按1.5方法进行处理，经HPLC－ELSD测定，没有待测物检出，故提取次数确定为3次.

综上，确定提取条件为：将干燥的珠子参粉碎，过60目筛，精密称取2.0g，分别用16mL甲醇连续回流3次，回流时间依次为1.5，1.0，1.0h，合并、浓缩提取液，以甲醇溶解，并定容至10.00mL.最佳条件下提取的24（R）－珠子参苷R1对照品和样品的色谱如图2所示.

图2 24（R）－珠子参苷R1 对照品（A）和珠子参样品（B）的色谱Fig.2 HPLC chromatograms of reference substances（A）and sample（B）of 24（R）－majoroside R1

3 方法与结果

3.1 线性关系考察

按照1.4方法制备1.00mg／mL对照品储备液，精密移取0.20，0.50，1.00，2.00，5.00mL储备液分别置于10.00mL容量瓶中，加色谱甲醇定容，得系列标准溶液，分别吸取标准溶液及对照品储备液20μL置于高效液相色谱仪，平行测定3次，取平均值；以对照品进样量的lg m值为x轴、对照品峰面积的lg S值为y轴做标准曲线，24（R）－珠子参苷R1的回归方程为

其线性范围为0.40～20.0μg.

3.2 精密度实验

将质量浓度为0.1，0.2，0.5mg／mL的对照品溶液各20μL置于高效液相色谱仪中，分别连续进样6次（日内精密度），测得24（R）－珠子参苷R1峰面积的RSD值分别为0.27%，0.52%和0.17%.连续进样3d，每天进样2次（日间精密度），测得24（R）－珠子参苷R1峰面积的RSD值分别为1.37%，1.61%和1.18%.

3.3 重复性实验

按1.5方法操作，制得6份供试品溶液，分别吸取20μL注入高效液相色谱仪进行测定，结果表明，24（R）－珠子参苷R1质量浓度的RSD＝0.96%（n＝6）.

3.4 稳定性实验

按1.5方法制备供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，10h按上述色谱条件进样测定，结果表明，24（R）－珠子参苷R1峰面积的RSD为1.71%，供试品在10h内完成测定即可.

3.5 加样回收率实验

将干燥的珠子参样品粉碎，过60目筛，精密称取2.0g（化合物24（R）－珠子参苷R1的质量分数为0.045 3%），共6份，每份均加入0.9mg的对照品，按1.5方法制备6份加标供试品溶液.对其质量浓度进行测定，测得24（R）－珠子参苷R1的平均回收率为98.7%，其RSD＝1.28%（n＝6）.

3.6 样品的测定

将分别购于河北省安国市和云南省昆明市的珠子参样品按1.5方法进行处理，分别取质量浓度为0.2mg／mL的对照品溶液及2份样品溶液各20μL置于高效液相色谱仪中，分别连续进样3次，记录峰面积，测得河北省安国市和云南省昆明市的珠子参根茎中24（R）－珠子参苷R1的质量比分别为3.06mg／g和0.45mg／g.

综上，本文采用HPLC－ELSD方法测定了不同产地珠子参根茎中新化合物24（R）－珠子参苷R1的质量比，并对其方法学进行了考察.结果表明，该方法可准确、快速测定珠子参中24（R）－珠子参苷R1的质量比，重复性及回收率较好，方法可靠.

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