孙昊+刘建国+朱桂梅+李海云+郝再彬

摘要通过微生物发酵法将剑麻皂苷转化成皂苷元.采集桂林喀斯特地貌土壤样品，从能够降解皂苷糖基的多个菌株中筛选出JM7，对其发酵条件进行优化，得到最适条件：温度30 ℃、pH为6、发酵时间5 d、底物质量浓度6 g/L，并且对产物皂苷元进行了HPLC检测和单晶衍射测定.

关键词剑麻皂苷；皂苷元；菌株筛选；发酵优化

中图分类号Q93；S567文献标识码A文章编号10002537（2014）04002904

工业生产剑麻纤维时剩余的抽丝汁液和残渣中含有丰富的剑麻皂苷资源，转化提取出的皂苷元可以改善小鼠糖耐量[1]；剑麻皂苷元能明显降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖水平，对肾上腺素高血糖大鼠也有降血糖作用[2].剑麻皂苷元（Tigogenin，图1）是螺甾烷醇的衍生物，是合成甾体激素类药物的医药中间体和重要原料，广泛应用于肾上腺皮质激素、性激素及蛋白同化激素，三大类激素可以制造200多种药物[34].用甲醇提取剑麻叶汁中的化合物，分离得到5个甾体皂苷 A、B、C、D、E[5]，均可用于皂苷元的转化.药理研究表明，这种皂苷元成分具有较明显的抗炎、抗菌、止血、抗衰老和降血糖的生物活性[6].

目前工业生产剑麻皂苷元采用硫酸加热回流提取法[7]，通过多次醇提酸解皂苷得到皂苷元产品.大量醇和酸对环境造成很大危害，同时也提高了生产成本.因此，新型的无污染低能耗的剑麻皂苷元生产方法亟待研究与开发，本实验筛选出产生剑麻皂苷元的高活性发酵微生物，为工业化生产开辟了一条新途径.

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种与培养基 土壤样品：实验室采集桂林喀斯特地貌的土壤样品200份.筛选培养基：绞股蓝皂苷2 g；琼脂2 g；硫酸亚铁0.001 g；硫酸镁0.05 g；氯化钠0.05 g；磷酸氢二钾005 g；硝酸钾0.1 g；水100 mL，用1 mol/L NaOH调节pH至7.5，121 ℃灭菌20 min，摇匀后倒平板.

酸钾、氢氧化钠、盐酸、香草醛、乙酸、高氯酸，以上试剂均为分析纯.

仪器：TU1800S 紫外分光光度计（美国VARIAN公司）；BS110S （塞多利斯）电子天平（北京塞多利斯有限公司）；LRH150Z振荡培养箱（广东省医疗器械厂）；DKS24 型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；垂直流超净工作台（上海智城分析仪器公司）；立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司）；岛津LC20AB高效液相色谱仪，ELSD检测器；氮气（99.9%，广西桂林海湾恒日化工气体有限公司）；KQ400KDE型高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SIGMA 3K30离心机（德国希格玛离心机有限公司）.

1.2实验方法

1.2.1制备皂苷标准曲线 比色法[8]：称量标准品剑麻皂苷5.00 mg，用甲醇溶解并定容至5 mL.分别吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和0.7 mL置于25 mL具塞试管中，以空白管作对照，在70 ℃下烘干后冷却至室温.各管中依次加入5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，摇匀后置于70 ℃烘箱中加热15 min，取出后迅速流水冷却至室温，再分别加入5 mL冰醋酸，摇匀，于450 nm处测定吸光度.以质量为横坐标，吸光度为纵坐标制备标准曲线.

色谱法[912]：Shimpack VPODS C18柱 （250 mm×4.6 mm，5μm），ELSDLTⅡ检测器，漂移管温度40 ℃，载气压力350 kPa，流动相为甲醇和水（体积比V（甲醇）∶〖KG-2mm〗V（水）=9∶〖KG-2mm〗1），流速1.0 mL/min，进样量10 μL，时间35 min.称量剑麻皂苷元标准品，甲醇为溶剂制备1 g/L标准溶液定容于容量瓶.

1.2.2菌种筛选 初筛：将标记好的土壤样品置于小花盆中，加入剑麻残渣以及PDA营养液，阴凉避光处放置一个月，期间周期性补充水分和营养液.

复筛：取初筛小花盆中的土壤样品，在筛选培养基上划线，由于皂苷有很强的抑菌性，一般的微生物种群难以在该培养基上生长，利用这种选择性即可初步得到可用的菌种群，再对其进行液体发酵培养测定产物含量，获得高活性菌种.

1.2.3发酵培养方法 制备发酵液：取干燥剑麻残渣打碎，加入自来水调至质量浓度为75 g/L，加热至沸腾2 h，4 500 r/min离心取上清液作为发酵液.发酵培养：按1%接种量将菌液接种于发酵培养基（300 mL瓶装液150 mL），于恒温培养箱内30 ℃ 下250 r/min震荡培养.

1.2.4发酵产物皂苷元检测 发酵结束后瓶中的发酵液4 500 r/min离心，沉淀即含有皂苷元代谢物，烘干粉碎后用三氯甲烷（20 mL/g沉淀物）超声震荡提取60 min，提取液4 500 r/min离心取上清液旋蒸浓缩后烘干得粉末，蒸馏水洗3次，烘干作为待测样品，进行HPLC检测.另取一部分待测样品溶于无水乙醇，常温下进行结晶，得到的样品晶体进行单晶衍射测定样品结构.

1.2.5发酵条件优化

2结果与讨论

2.1检测方法

按照1.2.1中所述方法绘制标准曲线（图2），剑麻皂苷质量为0.1～0.7 mg，曲线方程为y=1459 8x+0.030 7，R2为0.992 2，相关性较好，本实验中对发酵液中皂苷质量的测定均采用此法.

2.2菌种筛选

通过对200份土壤样品的初筛和复筛，共得到有降解皂苷效果的菌株13株（表1），其中JM4、JM5、JM7和JM12这4种菌株效果比较明显，最终选择降解率最高的菌种JM7号作为目的菌种进行后续实验.

2.3发酵产物测定

2.4发酵条件优化

2.4.1最适温度 温度对于剑麻皂苷降解率的影响如图5（A），从图中可以看出在30 ℃条件下发酵后剑麻皂苷降解率最高，达到52.6%，随着温度改变降解率降低，故最适温度为30 ℃.

2.4.2最适pH 如图5（B）所示，发酵液pH为6时发酵后剑麻皂苷的降解率最高，为53%，pH值改变后降解率显著下降，故确定发酵液最适pH为6.

2.4.3最适发酵时间 不同发酵时间后JM7对剑麻皂苷的降解率如图5（C），由图可知，降解率随发酵时间的增加而逐步增大，发酵5 d时降解率基本稳定在53%，此后继续发酵降解率基本无变化，增加发酵时间则无意义，故最优发酵时间为5 d.

2.4.4最适底物浓度 如图5（D）所示，由于剑麻皂苷本身具有较强的抑菌性，故随着皂苷质量浓度的增大降解率明显下降，皂苷为2 g/L时降解率最高，但考虑到降解皂苷的总量需要找到底物质量浓度尽可能大的一组，通过计算得出底物质3结论

通过多次筛选得到了一种能够降解剑麻皂苷生产剑麻皂苷元的高活性微生物，该菌种在偏酸性、低浓度发酵液中有着良好的降解能力，发酵5 d后降解率达到53%，使用HPLC方法和单晶衍射方法检测其发酵产物，可以确定其发酵产物为剑麻皂苷元.对其进行了不同发酵温度、发酵液pH、发酵时间和底物质量浓度下发酵的初步研究，得到最优发酵条件为：温度30 ℃，pH 6，发酵时间5 d，底物质量浓度6 g/L，该微生物的发现为工业化生产剑麻皂苷元提供了新的方法.

参考文献：

[1]〖ZK（#〗李燕婧，周桂芬，韦善新，等.剑麻皂苷药理作用的实验研究[J].时珍国医国药， 2006，17（10）：19581959.

[2]赖克道，李燕婧，李茂.剑麻皂苷降血糖作用的研究[J].广西科学院学报， 2010，26（1）：5658.

[3]吴立军，娄红祥，周晶.天然药物化学[M].北京：人民卫生出版社， 2011.

[4]计志忠.化学制药工艺学[M].北京：中国医药科技出版社，1997.

[5]DING Y， TIAN R H， YANG C R， et al. Two new steroidal saponins from dried femented residues of leafjuices of A gave sisalana form a dong No 1[J].Chem Pham Bull， 1993，41：557560.

[6]宣伟东，陈海生，谭兴起，等.HPLCELSD法测定刺蒺藜中甾体皂苷TTS12含量[J].第二军医大学学报， 2005，26（2）：222223.

[7]周寅，张梦宇，白杨，等.剑麻皂苷的分离纯化工艺研究[J].安徽农业科学， 2011，39（8）：45404542.

[8]马超，丁怡，王伟，等.剑麻总皂苷制备工艺研究[J].中国中药杂志， 2005，30（5）：391393.

2.4发酵条件优化

2.4.1最适温度 温度对于剑麻皂苷降解率的影响如图5（A），从图中可以看出在30 ℃条件下发酵后剑麻皂苷降解率最高，达到52.6%，随着温度改变降解率降低，故最适温度为30 ℃.

2.4.2最适pH 如图5（B）所示，发酵液pH为6时发酵后剑麻皂苷的降解率最高，为53%，pH值改变后降解率显著下降，故确定发酵液最适pH为6.

2.4.3最适发酵时间 不同发酵时间后JM7对剑麻皂苷的降解率如图5（C），由图可知，降解率随发酵时间的增加而逐步增大，发酵5 d时降解率基本稳定在53%，此后继续发酵降解率基本无变化，增加发酵时间则无意义，故最优发酵时间为5 d.

2.4.4最适底物浓度 如图5（D）所示，由于剑麻皂苷本身具有较强的抑菌性，故随着皂苷质量浓度的增大降解率明显下降，皂苷为2 g/L时降解率最高，但考虑到降解皂苷的总量需要找到底物质量浓度尽可能大的一组，通过计算得出底物质3结论

通过多次筛选得到了一种能够降解剑麻皂苷生产剑麻皂苷元的高活性微生物，该菌种在偏酸性、低浓度发酵液中有着良好的降解能力，发酵5 d后降解率达到53%，使用HPLC方法和单晶衍射方法检测其发酵产物，可以确定其发酵产物为剑麻皂苷元.对其进行了不同发酵温度、发酵液pH、发酵时间和底物质量浓度下发酵的初步研究，得到最优发酵条件为：温度30 ℃，pH 6，发酵时间5 d，底物质量浓度6 g/L，该微生物的发现为工业化生产剑麻皂苷元提供了新的方法.

参考文献：

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[7]周寅，张梦宇，白杨，等.剑麻皂苷的分离纯化工艺研究[J].安徽农业科学， 2011，39（8）：45404542.

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2.4发酵条件优化

2.4.1最适温度 温度对于剑麻皂苷降解率的影响如图5（A），从图中可以看出在30 ℃条件下发酵后剑麻皂苷降解率最高，达到52.6%，随着温度改变降解率降低，故最适温度为30 ℃.

2.4.2最适pH 如图5（B）所示，发酵液pH为6时发酵后剑麻皂苷的降解率最高，为53%，pH值改变后降解率显著下降，故确定发酵液最适pH为6.

2.4.3最适发酵时间 不同发酵时间后JM7对剑麻皂苷的降解率如图5（C），由图可知，降解率随发酵时间的增加而逐步增大，发酵5 d时降解率基本稳定在53%，此后继续发酵降解率基本无变化，增加发酵时间则无意义，故最优发酵时间为5 d.

2.4.4最适底物浓度 如图5（D）所示，由于剑麻皂苷本身具有较强的抑菌性，故随着皂苷质量浓度的增大降解率明显下降，皂苷为2 g/L时降解率最高，但考虑到降解皂苷的总量需要找到底物质量浓度尽可能大的一组，通过计算得出底物质3结论

通过多次筛选得到了一种能够降解剑麻皂苷生产剑麻皂苷元的高活性微生物，该菌种在偏酸性、低浓度发酵液中有着良好的降解能力，发酵5 d后降解率达到53%，使用HPLC方法和单晶衍射方法检测其发酵产物，可以确定其发酵产物为剑麻皂苷元.对其进行了不同发酵温度、发酵液pH、发酵时间和底物质量浓度下发酵的初步研究，得到最优发酵条件为：温度30 ℃，pH 6，发酵时间5 d，底物质量浓度6 g/L，该微生物的发现为工业化生产剑麻皂苷元提供了新的方法.

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[3]吴立军，娄红祥，周晶.天然药物化学[M].北京：人民卫生出版社， 2011.

[4]计志忠.化学制药工艺学[M].北京：中国医药科技出版社，1997.

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[6]宣伟东，陈海生，谭兴起，等.HPLCELSD法测定刺蒺藜中甾体皂苷TTS12含量[J].第二军医大学学报， 2005，26（2）：222223.

[7]周寅，张梦宇，白杨，等.剑麻皂苷的分离纯化工艺研究[J].安徽农业科学， 2011，39（8）：45404542.

[8]马超，丁怡，王伟，等.剑麻总皂苷制备工艺研究[J].中国中药杂志， 2005，30（5）：391393.