张良等

摘要：为了优化金针菇（Flammulina velutiper Sing）菌糠多糖的提取工艺，在单因素试验的基础上根据Box-Behnken中心组合试验设计原理对提取时间、水料比、提取温度进行三因素三水平的试验设计，采用响应面软件Design-Expert进行处理，得到金针菇菌糠多糖的最佳提取条件为：提取温度95 ℃，水料比15∶1，提取4.26 h，此条件下提取的多糖含量为13.704 mg/mL，与预测值13.320 mg/mL十分接近，表明该模型可行。

关键词：金针菇（Flammulina velutiper Sing）；菌糠；多糖；响应面分析法

中图分类号：Q53；S646.1+5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）16-3886-04

Abstract： Single-factor experiments and Box-Behnken central composite design were used to optimize the extraction of polysaccharides from waste materials of mushroom. The three factors and three levels including the extraction time， water-material ratio， extraction temperature of the experiment were designed. Response surface processing Design-Expert software was used. Results showed that optimal extraction conditions were temperature of 95 ℃， water-material ratio 15：1， time of 4.26 h. This condition could obtain 13.704 mg/mL polysaccharide， close to the predicting result of 13.320 mg/mL， proving that the model was feasible.

Key words：mushroom； waste material； polysaccharide； response surface analysis method

金针菇（Flammulina velutiper Sing）属伞菌目白蘑科金针菇属， 其味道清新淡雅，营养丰富，是拌凉菜和火锅的上好食材。从金针菇中提取的多糖具有增强淋巴细胞免疫活性[1]的作用，可以抗肿瘤、抗白血病[2]，并且在体外有较好的抗氧化活性[3]。经过化学修饰的金针菇多糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑菌活性[4]。除此之外，动物试验说明对特定类型的记忆障碍，其治疗效果与脑复新相当[5]。一些学者对真菌中提取的多糖做了大量研究，但是鲜见有从金针菇菌糠中提取多糖的报道[6-8]。

本试验主要研究提取温度、水料比和提取时间对金针菇多糖提取量的影响，并且应用响应面法对提取工艺参数进行了优化，以获得金针菇多糖提取的最佳条件，为大规模工业提取提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金针菇菌糠；葡萄糖、浓硫酸、苯酚，以上皆为分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

电热鼓风干燥箱；分光光度计；水浴锅；电子天平；高速离心机。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理 将圆柱状的金针菇菌糠掰碎至花生大小，然后放入鼓风干燥箱中，在60 ℃的条件下烘干至恒重。粉碎，过20目筛存放至干燥处备用。

1.3.2 金针菇多糖提取及检测过程 菌糠→不同条件下浸提→离心后取上清液→上清液稀释20倍后取1 mL→加入0.5 mL 6%的苯酚试剂和2.5 mL的浓硫酸试剂→摇匀→静置20 min→在490 nm的波长处测吸光度。

1.3.3 标准曲线的制作 准确称取标准品葡萄糖20 mg于500 mL容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，以去离子水补至1.0 mL，然后加入6%苯酚0.5 mL及浓硫酸2.5 mL，摇匀冷却，室温放置20 min后于490 nm处测吸光度，以1.0 mL去离子水作为空白，横坐标为葡萄糖浓度，纵坐标为吸光度，结果见图1。

1.3.4 单因素试验

1）提取时间。精确称取10 g金针菇菌糠于250 mL锥形瓶中，加入200 mL去离子水，摇匀至菌糠全部湿润，然后分别在95 ℃的条件下加热1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h，冷却，于3 000 r/min的条件下离心5 min，取上清液，稀释20倍后取1 mL，分别加入6%的苯酚0.5 mL及浓硫酸2.5 mL，摇匀冷却，室温放置20 min后在490 nm处测吸光度，对照标准曲线得多糖含量。

2）水料比。精确称取5 g金针菇菌糠，分别按照10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1的水料比（V/m，mL∶g，下同）加去离子水，摇匀至菌糠全部润湿，95 ℃水浴4 h，测多糖含量。

3）提取温度。精确称取10 g金针菇菌糠于250 mL锥形瓶中，加入200 mL去离子水，摇匀至菌糠完全润湿，然后分别在65、70、75、80、85、90、95 ℃条件下水浴4 h，测多糖含量。

1.3.5 正交试验设计 根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，结合单因素试验结果，分别选取对多糖提取量有显著影响的温度、水料比、时间， 应用三水平三因素的响应面分析方法进行试验。因素与水平见表1。endprint

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取时间对多糖含量的影响 由图2可知，开始时，随着提取时间的延长，多糖的含量处于上升的趋势，提取时间为3.5～4.0 h时，多糖含量达到最高。其后，随着提取时间的增加，多糖含量由于水解作用反而降低，故提取时间选择4.0 h。

2.1.2 水料比对多糖含量的影响 由图3可知，随着水比例的增加，多糖含量呈先升高后降低的趋势，势，在水料比为15∶1时多糖含量达到最高，故选择水料比为15∶1。

2.1.3 提取温度对多糖含量的影响 由图4可知，随着提取温度的升高，提取液中的多糖含量不断上升，当提取温度升至85～95 ℃时，多糖含量上升幅度趋于平缓。但过高的温度可以使水分蒸发过多，有可能使多糖水解导致含量下降，所以温度不宜超过95 ℃。

2.2 响应面试验结果

对金针菇多糖的提取工艺进行响应面分析，试验方案和结果见表2。

2.2.1 各因素间的相互影响 采用相应软件Design-Expert进行响应面处理。将表2的试验结果输入软件后可以得到时间-水料比、时间-温度、温度-水料比的相互关系图。

从图2至图4中可以看出，水料比是影响提取多糖含量的最大因素，时间和温度对提取含量的的影响程度相近。

2.2.2 最佳条件确定 从Design-Expert软件中可以得到回归方程：R=118.625 20+26.671 02X1-1.356 82X2-3.374 60X3-0.082 830X1X2-0.036 813 X1X3-0.003 94X2X3-2.574 49X12+0.036 728X22+0.020 640X32，通过软件求偏微分方程得到最佳条件为：提取时间4.26 h，温度95 ℃，水料比15∶1。为验证用响应面优化后的最佳提取条件是否可靠，采用以上试验条件进行提取，得到的产物中多糖含量为13.704 mg/mL，与预测值13.320 mg/mL十分接近，表明该模型可行。因此用响应面法优化得到的最佳提取条件具有实用价值。

3 结论

通过对金针菇菌糠多糖提取温度、水料比、时间三个条件的单因素试验设计，并且针对这三个因素三水平的响应面进行分析，得到金针菇菌糠多糖的最佳提取工艺为：提取温度95 ℃，提取时间4.26 h，提取水料比15∶1，此时多糖含量为13.704 mg/mL。

参考文献：

[1] 王玉峰，王 旻，尹鸿萍.金针菇菌丝体中多糖的分离、结构鉴定及免疫学活性[J].中国天然药物，2008，6（4）：312-315.

[2] 苗立成，王立强，吴 迪.金针菇多糖对小鼠抗肿瘤及抗白血病效应的实验研究[J].解放军药学学报，2003，19（3）：171-173.

[3] 叶 敏.金针菇多糖的提取及清除羟自由基活性研究[J].毕节学院学报（综合版），2011，29（4）：90-94.

[4] 刘 莹，许 琳，赵 杰.金针菇多糖衍生物的制备及其抗菌性的测定[J].食品工业科技，2013，34（6）：137-139.

[5] 邹 宇，廖森泰，吴娱明，等.金针菇多糖提取物对记忆障碍模型大鼠、小鼠学习记忆能力的影响[J].中国食品学报，2010（1）：26-30.

[6] 马寿福，军 花，刁治民，等.食用菌菌糠营养价值及利用途径的研究[J].青海草业，2006，15（3）：36-40.

[7] 王永军，田秀娥，李浩波.菌糠的营养价值与开发利用[J].中国饲料，2001（12）：30-31.

[8] 刘晓牧，王中华，李福昌，等.菌糠的营养价值及其应用饲料与畜牧[J].饲料与畜牧，2000，8（6）：12-13.

（责任编辑 龙小玲）endprint

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取时间对多糖含量的影响 由图2可知，开始时，随着提取时间的延长，多糖的含量处于上升的趋势，提取时间为3.5～4.0 h时，多糖含量达到最高。其后，随着提取时间的增加，多糖含量由于水解作用反而降低，故提取时间选择4.0 h。

2.1.2 水料比对多糖含量的影响 由图3可知，随着水比例的增加，多糖含量呈先升高后降低的趋势，势，在水料比为15∶1时多糖含量达到最高，故选择水料比为15∶1。

2.1.3 提取温度对多糖含量的影响 由图4可知，随着提取温度的升高，提取液中的多糖含量不断上升，当提取温度升至85～95 ℃时，多糖含量上升幅度趋于平缓。但过高的温度可以使水分蒸发过多，有可能使多糖水解导致含量下降，所以温度不宜超过95 ℃。

2.2 响应面试验结果

对金针菇多糖的提取工艺进行响应面分析，试验方案和结果见表2。

2.2.1 各因素间的相互影响 采用相应软件Design-Expert进行响应面处理。将表2的试验结果输入软件后可以得到时间-水料比、时间-温度、温度-水料比的相互关系图。

从图2至图4中可以看出，水料比是影响提取多糖含量的最大因素，时间和温度对提取含量的的影响程度相近。

2.2.2 最佳条件确定 从Design-Expert软件中可以得到回归方程：R=118.625 20+26.671 02X1-1.356 82X2-3.374 60X3-0.082 830X1X2-0.036 813 X1X3-0.003 94X2X3-2.574 49X12+0.036 728X22+0.020 640X32，通过软件求偏微分方程得到最佳条件为：提取时间4.26 h，温度95 ℃，水料比15∶1。为验证用响应面优化后的最佳提取条件是否可靠，采用以上试验条件进行提取，得到的产物中多糖含量为13.704 mg/mL，与预测值13.320 mg/mL十分接近，表明该模型可行。因此用响应面法优化得到的最佳提取条件具有实用价值。

3 结论

通过对金针菇菌糠多糖提取温度、水料比、时间三个条件的单因素试验设计，并且针对这三个因素三水平的响应面进行分析，得到金针菇菌糠多糖的最佳提取工艺为：提取温度95 ℃，提取时间4.26 h，提取水料比15∶1，此时多糖含量为13.704 mg/mL。

参考文献：

[1] 王玉峰，王 旻，尹鸿萍.金针菇菌丝体中多糖的分离、结构鉴定及免疫学活性[J].中国天然药物，2008，6（4）：312-315.

[2] 苗立成，王立强，吴 迪.金针菇多糖对小鼠抗肿瘤及抗白血病效应的实验研究[J].解放军药学学报，2003，19（3）：171-173.

[3] 叶 敏.金针菇多糖的提取及清除羟自由基活性研究[J].毕节学院学报（综合版），2011，29（4）：90-94.

[4] 刘 莹，许 琳，赵 杰.金针菇多糖衍生物的制备及其抗菌性的测定[J].食品工业科技，2013，34（6）：137-139.

[5] 邹 宇，廖森泰，吴娱明，等.金针菇多糖提取物对记忆障碍模型大鼠、小鼠学习记忆能力的影响[J].中国食品学报，2010（1）：26-30.

[6] 马寿福，军 花，刁治民，等.食用菌菌糠营养价值及利用途径的研究[J].青海草业，2006，15（3）：36-40.

[7] 王永军，田秀娥，李浩波.菌糠的营养价值与开发利用[J].中国饲料，2001（12）：30-31.

[8] 刘晓牧，王中华，李福昌，等.菌糠的营养价值及其应用饲料与畜牧[J].饲料与畜牧，2000，8（6）：12-13.

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2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取时间对多糖含量的影响 由图2可知，开始时，随着提取时间的延长，多糖的含量处于上升的趋势，提取时间为3.5～4.0 h时，多糖含量达到最高。其后，随着提取时间的增加，多糖含量由于水解作用反而降低，故提取时间选择4.0 h。

2.1.2 水料比对多糖含量的影响 由图3可知，随着水比例的增加，多糖含量呈先升高后降低的趋势，势，在水料比为15∶1时多糖含量达到最高，故选择水料比为15∶1。

2.1.3 提取温度对多糖含量的影响 由图4可知，随着提取温度的升高，提取液中的多糖含量不断上升，当提取温度升至85～95 ℃时，多糖含量上升幅度趋于平缓。但过高的温度可以使水分蒸发过多，有可能使多糖水解导致含量下降，所以温度不宜超过95 ℃。

2.2 响应面试验结果

对金针菇多糖的提取工艺进行响应面分析，试验方案和结果见表2。

2.2.1 各因素间的相互影响 采用相应软件Design-Expert进行响应面处理。将表2的试验结果输入软件后可以得到时间-水料比、时间-温度、温度-水料比的相互关系图。

从图2至图4中可以看出，水料比是影响提取多糖含量的最大因素，时间和温度对提取含量的的影响程度相近。

2.2.2 最佳条件确定 从Design-Expert软件中可以得到回归方程：R=118.625 20+26.671 02X1-1.356 82X2-3.374 60X3-0.082 830X1X2-0.036 813 X1X3-0.003 94X2X3-2.574 49X12+0.036 728X22+0.020 640X32，通过软件求偏微分方程得到最佳条件为：提取时间4.26 h，温度95 ℃，水料比15∶1。为验证用响应面优化后的最佳提取条件是否可靠，采用以上试验条件进行提取，得到的产物中多糖含量为13.704 mg/mL，与预测值13.320 mg/mL十分接近，表明该模型可行。因此用响应面法优化得到的最佳提取条件具有实用价值。

3 结论

通过对金针菇菌糠多糖提取温度、水料比、时间三个条件的单因素试验设计，并且针对这三个因素三水平的响应面进行分析，得到金针菇菌糠多糖的最佳提取工艺为：提取温度95 ℃，提取时间4.26 h，提取水料比15∶1，此时多糖含量为13.704 mg/mL。

参考文献：

[1] 王玉峰，王 旻，尹鸿萍.金针菇菌丝体中多糖的分离、结构鉴定及免疫学活性[J].中国天然药物，2008，6（4）：312-315.

[2] 苗立成，王立强，吴 迪.金针菇多糖对小鼠抗肿瘤及抗白血病效应的实验研究[J].解放军药学学报，2003，19（3）：171-173.

[3] 叶 敏.金针菇多糖的提取及清除羟自由基活性研究[J].毕节学院学报（综合版），2011，29（4）：90-94.

[4] 刘 莹，许 琳，赵 杰.金针菇多糖衍生物的制备及其抗菌性的测定[J].食品工业科技，2013，34（6）：137-139.

[5] 邹 宇，廖森泰，吴娱明，等.金针菇多糖提取物对记忆障碍模型大鼠、小鼠学习记忆能力的影响[J].中国食品学报，2010（1）：26-30.

[6] 马寿福，军 花，刁治民，等.食用菌菌糠营养价值及利用途径的研究[J].青海草业，2006，15（3）：36-40.

[7] 王永军，田秀娥，李浩波.菌糠的营养价值与开发利用[J].中国饲料，2001（12）：30-31.

[8] 刘晓牧，王中华，李福昌，等.菌糠的营养价值及其应用饲料与畜牧[J].饲料与畜牧，2000，8（6）：12-13.

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