马悦培 ， 杨 欢 ， 张军民 ＊， 赵青余 ， 高红亮

（1.中国农业科学院畜牧兽医研究所 农业部华北动物遗传资源与营养科学观测实验站，北京海淀 100193；2.华东师范大学，上海闵行 200062；3.甘肃农业大学，甘肃兰州 730070；4.中国农业科学院世界农用林业中心 农用林业与可持续畜牧业联合实验室，北京海淀 100193）

蒙脱石是一种具有双八面体层状结构的天然纳米级铝硅酸盐矿物质，因其具有较大的比表面积和层间可交换阳离子的存在，使蒙脱石具有吸附和交换性能，且其来源广泛、价格低廉、性质稳定，可作为抗菌金属离子的理想载体材料（韩跃新等，2006）。蒙脱石对重金属离子的吸附特性是当前科学领域的研究热点，已有很多学者在这方面做了深入研究 （何宏平和郭九皋，1999）。孟艳丽（2011）研究蒙脱石、凹凸棒石及其复合物对断奶仔猪肠道保护作用，结果表明这三种物质能够降低断奶仔猪腹泻率，具有提高仔猪饲料转化率的趋势。谢仲权和张军民（2009）认为，蒙脱石可通过对消化道内的重金属、细菌以及有害气体的强烈吸附作用起到对动物的保健作用。胡秀荣等（2002）在含细菌数约为1×107cfu/mL的人工肠液中，加入不同量的蒙脱石，置于培养箱中培养，计数菌落数。结果表明：蒙脱石对细菌无抑制或杀灭作用，蒙脱石对细菌的作用主要是吸附，且吸附力强弱与其带电性有关中。许多重金属离子和重金属化合物有抗菌消毒的作用，特别是银离子在低浓度下即具有较高生物活性。利用蒙脱石结构稳定、吸附性强、离子交换容量大等特点，可将Cu2+、Ag+加载到其特殊结构中，制备出天然抗菌剂，从而将蒙脱石的吸附作用与重金属离子的杀菌作用结合起来，添加到饲料中以充分发挥蒙脱石的有利作用。

本试验以提纯的蒙脱石为载体，制备载铜、载银蒙脱石；对制备的四种载铜、载银蒙脱石进行了X射线衍射（XRD）；以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌为指示菌，测定四种载铜、载银蒙脱石的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），评价其抗菌性能，从而为载铜、载银蒙脱石作为饲用抗生素的替代品和无机抗菌材料提供数据和理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂 蒙脱石M1、蒙脱石M2均由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所制备。

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，均由华东师范大学生命科学学院微生物学实验室分离并保存。

营养琼脂培养基参考谢仲权和张军民（2009）的方法：蛋白胨10.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，牛肉浸出粉3～5 g/L。灭菌后，该培养基pH值应为7.2±0.2。

主要试剂有：邻苯二甲酸氢钾、氯化铵、硝酸银、氢氧化钠、甲醛、乙醇、亚甲基蓝、酚酞、焦磷酸钠、氨水、氯化钙、盐酸、硝酸铜等均为分析纯试剂，由国药集团、北京北化精细化学品公司、北京化学制剂有限公司等公司提供。

1.1.2 仪器与设备 台式高速离心机（H-1650型，湖南湘仪）；Ag-S电极，Cu电极，甘汞电极（上海罗素）；精密酸度计（PHC-3CT型，上海大普）；磁力搅拌器（H01-1C型，上海梅颖浦）；恒温水浴锅（HHS型，上海博迅）；恒温鼓风干燥箱（DHG-9070A1型，上海精宏）；培养箱（SPX-150B-2型，上海博迅）。

1.2 试验方法

1.2.1 蒙脱石载铜、载银试验 载铜试验条件为：90 ℃水浴，反应时间 6 h，固液比 1∶20，Cu（NO3）2浓度 0.05 mol/L，3000 r/min，离心 10 min，上清移入容量瓶，沉淀用去离子水洗涤数次，离心，每次

式中：V为溶液体积，mL；m为吸附剂用量，g；C0、C为吸附前后重金属离子浓度，mol/L。

1.2.2 载铜、载银蒙脱石X射线衍射 本试验采用DmA1x12kW粉末衍射仪，石墨弯晶单色器和 CuKα（0.15418 nm）X 射线，管电压 40 kV，管电流100 mA，扫描方式是 θ/2θ扫描，扫描速度为 8°（2θ）/分，采数步宽为 0.01°（2θ），环境温度为（15.0±1）℃，湿度是（20.0±5）%。 试验操作按照标准SY/T6210-1996进行，委托北京北达燕园微构分析测试中心完成。

1.2.3 载铜、载银蒙脱石抑菌圈大小的测定 取无菌培养皿，分别加入约20 mL固体培养基，凝固作为底层，另取冷却至50℃左右的半固体培养基5 mL，加入0.2 mL含菌量约106cfu/mL菌悬液，迅速摇匀倒在底层平板上，并晃动平板，使其铺满，作为菌层。稍干后用直径5 mm的打孔器打孔，将4种载铜、载银蒙脱石加于孔中，以满而不溢为宜，并作好标记。于37℃培养24 h后，测量抑菌圈大小。

1.2.4 最小抑菌浓度的测定 采用常量肉汤稀释法，取无菌试管13支，排成一排，除第1管加入2 mL营养琼脂培养基外，其余每管加入1 mL培养基，在第1管加入样品0.256 g，混匀，然后吸取1 mL至第2管，混匀后再吸取1 mL至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1 mL弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为 256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg/mL。然后在上述每管内加入制备好的含1×106～2×106cfu/mL指示菌各1 mL，使每管最终菌液浓度约为5×105cfu/mL。第1管至第 11 管药物浓度分别为 128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL（田文莹等，2009）。

将接种好的无菌试管塞好塞子，置30℃普通空气孵箱中孵育24 h。以肉眼观察，药物最低浓离心后的上清都移入容量瓶，洗涤4次后，定溶，测定容量瓶中Cu2+的浓度，计算样品的吸附量和利用率；载银试验条件为：60℃水浴，反应时间3 h，固液比 1∶20，AgNO3浓度 0.03 mol/L，3000 r/min，离心10 min，其他步骤同上（夏枚生等，2006）。试验采用离子选择电极法测定Cu2+、Ag+浓度，计算吸附量（Q）采用公式：度管无细菌生长者，即为MIC。读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。

1.2.5 最小杀菌浓度的测定 从制备的4种载铜、载银蒙脱石浓度高于MIC（包括MIC）的各瓶中吸取1 mL于平板上，霉菌于28℃培养72 h，酵母于28℃培养48 h，细菌于37℃培养24 h后，观察结果，无菌生长的最低添加量为MBC。

2 结果

2.1 载铜、载银蒙脱石中铜、银含量 蒙脱石载铜、载银后铜、银含量见表1。

表1 载铜、载银蒙脱石中Cu2+、Ag+含量

蒙脱石加载Cu2+、Ag+前后通过XRD测定的矿物成分及含量见表2，载铜、载银蒙脱石含有蒙脱石中没有的碳酸银，氧化银和孔雀石（碱式碳酸铜）。

表2 不同样品的矿物成分及含量 %

2.2 载铜、载银蒙脱石X射线衍射 载铜、载银蒙脱石XRD图谱和原蒙脱石XRD图谱的对照见图1、图2，XRD图谱无明显差别。原蒙脱石M1的d（001）值为 14.985 Å，加载Cu2+、Ag+后的蒙脱石 M1的 d（001）值分别为14.341 Å 和 15.280 Å。 原蒙脱石M2的 d（001）值为 12.801 Å，加载 Cu2+、Ag+后的蒙脱石 M2的 d（001）值分别为 14.251 Å 和 14.985 Å。

2.3 载铜、载银蒙脱石的抑菌圈 由表3可知，Ag+-M1、Ag+-M2抑菌圈直径均在13.0 mm左右。抑菌圈越大，抗菌性能越好。由此可见，加载银离子的蒙脱石具有更好的抑菌性能。

图1 Cu2+-M1、Ag+-M1、M1 的 XRD 图谱

图2 Cu2+-M2、Ag+-M2、M2 的 XRD 图谱

表3 载铜、载银蒙脱石的抑菌圈直径mm

2.4 载铜、载银蒙脱石的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度 载铜、载银蒙脱石对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC和MBC的影响，结果见表4和表5。

表4 载铜、载银蒙脱石的MICmg/mL

表5 载铜、载银蒙脱石的MBC

Ag+-M1对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC为0.125 mg/mL和0.25 mg/mL；Ag+-M2对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC均为0.125 mg/mL。Ag+-M2对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MBC最低，分别为0.125 mg/mL和0.25 mg/mL。因此，载银蒙脱石抗菌性能优于载铜蒙脱石。

3 讨论

3.1 载铜、载银前后蒙脱石XRD的表征 蒙脱石的层内四次配位和六次配位的原子发生替代而产生负电荷，通过层间可交换阳离子来补偿。蒙脱石特殊的层间结构，在加水后能发生膨胀，对阳离子具有很强的吸附力和交换能力。阳离子的价态与半径均与蒙脱石的层间距有关系。蒙脱石层间距通常由XRD分析获得的蒙脱石面网间距d（001）值确定。由载铜、载银蒙脱石XRD图谱和蒙脱石XRD图谱（图 1、图 2）对比可见，原蒙脱石 M1的 d（001）值为14.985 Å，近似为钙基蒙脱石。原蒙脱石 M2的 d（001）值为 12.801 Å，为钠基蒙脱石（苗春省，1984）。 原蒙脱石 M1加载 Cu2+后 d（001）值变小，则搭载 Cu2+以后蒙脱石的层间距减小。在吸附Cu2+的蒙脱石及其热处理产物的EPR研究中发现，水合铜离子进人层间后，并不是稳定地滞留在蒙脱石的层间，有相当一部分Cu2+进入到Si-O四面体片中的复三方形孔洞中，也有部分Cu2+进入了八面体片中，这与Cu2+有较小的离子半径关系密切 （Stadler和Schindler，1993），可能是搭载Cu2+以后蒙脱石的层间距减小的原因。Cu2+离子半径为0.073 nm，与Al3+离子半径0.072 nm非常相近，Cu2+进入八面体片后，对其晶体稳定性没有很大的影响。大部分八面体阳离子仍保持原位置未变，故并没有改变其原有的晶体结构（何宏平和郭九皋，1999）。因此，蒙脱石在加载铜离子、银离子后仍保持很好的吸附性能，以保证发挥较好的抗菌性能。 原蒙脱石 M2加载 Cu2+后 d（001）值变小，则搭载Cu2+以后蒙脱石的层间距增大，这可能是因为大部分交换的Cu2+以水和离子形式存在层间。原蒙脱石M1、M2加载 Ag+后 d（001）值都变大，则搭载 Ag+以后蒙脱石的层间距增大。由于钙的离子半径（0.1 nm）和钠的离子半径 （0.092 nm）比银的离子半径（0.126 nm）小，所以当银离子通过离子交换的方式进入层间后，会使得层间距增大（余焕焕等，2013）。

蒙脱石加载铜离子、银离子前后通过XRD测定的矿物成分及含量，载铜、载银蒙脱石含有蒙脱石原矿中没有的碳酸银，氧化银和孔雀石（碱式碳酸铜），说明Cu2+、Ag+加载到蒙脱石后存在氧化现象。银离子无论是在见光、受热等条件下都极易还原成金属银。银离子还能与水介质中的多种阴离子反应，形成不溶于水的AgCl等。因此，实际应用中，应保证适宜的载银量以降低原料成本和防止无机抗菌材料的氧化变色，制备的矿物抗菌剂应尽快密封保存，尽量避免Cu2+、Ag+被氧化而影响杀菌效果。

3.2 载铜、载银蒙脱石抗菌机理与抗菌效果 天然矿物抗菌剂的作用机理有以下几种假说：有观点认为，蒙脱石加载Cu2+、Ag+，与指示菌接触后，由于Cu2+、Ag+的还原性较强，离子交换所吸附的离子逐渐从层间域中溶出，而和细菌的细胞膜结合在一起，并穿透细胞壁，通过和细菌中的蛋白质和核酸反应，阻碍细菌的生物合成和能量传递，引起细菌酶蛋白变性和细胞膜生物学性质的破坏和损伤，使细菌失活，从而达到较好的杀菌效果 （Alvarez-Puebla等，2004）。也有一种观点认为，载铜蒙脱石具有较好的杀菌活性是因为，搭载铜离子后的蒙脱石表面电荷发生变化，增强了蒙脱石与细菌的静电吸附作用。另外，还有一种解释认为，银离子具有催化氧化性能，能氧化空气和水中的氧形成羟基自由基和活性氧离子，破坏微生物的繁殖能力，起到抑菌和杀菌作用。

余志伟等 （2003）杀菌试验表明，膨润土与Ag+、Cu2+、Zn2+三种金属离子制得的抗菌材料，都具有很好的杀菌抑菌效果，对大肠杆菌的杀灭率为100%，是理想的抗菌材料，与本试验的研究结果较相符。加载银离子的抗菌剂的抗菌性能优于加载铜离子的抗菌剂，这可能是由于抗菌剂的抑菌性能与加载的金属离子相关。Cu2+由于化学活性弱于Ag+，故其抑菌效果稍差。马玉龙和郭彤（2007）有关载铜蒙脱石及其杀灭大肠杆菌机制的研究中得出结论为载铜蒙脱石对大肠杆菌的MIC和MBC分别为0.16 mg/mL和0.64 mg/mL。本试验的结果与其存在一定差距，可能原因是蒙脱石原矿间存在的差异以及银离子的吸附条件导致的吸附量不同，而影响其抗菌性能。王宁等（2000）有关非金属矿物在抗菌材料中的应用的研究中表明，载银蒙脱石对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的的MIC分别为125 mg/L和250 mg/L，本试验的结果与其结论基本一致。

4 结论

载铜、载银后的蒙脱石层间距发生变化，其优异的吸附性和胶体性能依然存在。载铜、载银蒙脱石对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有较强的抗菌性能，载银蒙脱石的抗菌效果优于载铜蒙脱石。

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