方卢秋, 欧文林

（长江师范学院 化学化工学院,重庆 涪陵408100）

1 预备知识

近年来,发生在国内婴幼儿奶粉受三聚氰胺污染导致婴幼儿肾结石事件以及在美国发生多起饲料致死宠物事件,使三聚氰胺成为国内外公众关注的热点［1-2］.三聚氰胺（Melamine,简写为 Mel,化学式为C3H6N6）,学名三氨三嗪,俗称蜜胺、蛋白精,是一种三嗪类含氮杂环的有机化合物；主要用于制造三聚氰胺甲醛树脂,普遍存在于塑料、涂料等材料中.微溶于水,可溶于甲醇、甲醛、热乙二醇、甘油、吡啶等,不溶于丙酮、醚类［3］.因食品和饲料工业蛋白质含量测定大多采用总氮测定的方法,而三聚氰胺含氮量高达66%左右［4］,常被非法添加到食品和饲料中以提高蛋白质的含量指标,给消费者健康带来危害.

目前,国内外检测食品及饲料中三聚氰胺残留,通常采用液相色谱法［5］、气相色谱 -质谱法［6］、液相色谱 -质谱法［7］、毛细管电泳技术等［8］,这些方法成本较高,在检测前都需要进行复杂的样品预处理,如对样品进行液-液萃取后,采用多步柱净化和富集.

分子印迹技术是近几十年来发展起来的一种包含多种学科的研究方法.分子印迹聚合物（MIP）对目标分子具有高度的选择性,且性能稳定、价格低廉,可以解决样品前处理复杂、成本较高等问题,至今已被用于传感器、色谱分离、固相萃取和人工抗体等领域［9-10］.为了选择性地富集分离与特异性地分子识别三聚氰胺,人们研究合成了几种三聚氰胺分子印迹聚合物［11-13］.

本研究以三聚氰胺为模板分子,优化选择了溶剂；以丙烯酰胺、甲基丙烯酸、丙烯酸、邻氨基酚、甲基丙烯酸甲酯为功能单体进行选择实验；以二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂,以偶氮二异丁腈为引发剂,分别进行本体聚合法和沉淀聚合法制备MIP和NIP（不含模板分子的空白分子印迹聚合物）,选择较优的制备方法；并对三聚氰胺分子印迹聚合物的分子识别机理进行实验研究.

2 实验部分

2.1 试剂与仪器丙烯酸（简写为AA,成都市科龙化工试剂厂）；a-甲基丙烯酸（简写为MAA,成都市科龙化工试剂厂）；甲基丙烯酸甲酯（简写为MMA,成都市科龙化工试剂厂）；丙烯酰胺（简写为AM,成都市科龙化工试剂厂）；邻氨基酚（简写为OAP,五联化工厂）；二甲基丙烯酸乙二醇酯（简写为EGDMA,东京化成工业株式会社）；偶氮二异丁腈（简写为AIBN,成都市科龙化工试剂厂）；三聚氰胺（成都科龙化工试剂厂）；甲醇（简写为Met,色谱纯,天津市大茂化学试剂厂）；乙腈（色谱纯,天津市光复精细化工研究所）；冰醋酸（成都市科龙化工试剂厂）；高纯氮气；以上化学试剂均为分析纯,实验中所使用的水均为超纯水.

AA、MAA、MMA、AM、EGDMA、AIBN 使用前精制方法如下所述.

丙烯酸的精制:移取50 mL AA,加10.0 g活性炭颗粒,振荡30 min,干过滤后置于4℃冰箱中保存.

α-甲基丙烯酸的精制:移取50 mL MAA,加入10.0 g活性炭颗粒,振荡30 min后干过滤,置于4℃恒温箱中保存.

甲基丙烯酸甲酯的精制:在500 mL分液漏斗中加入250 mL甲基丙烯酸甲酯,用质量分数5%NaOH溶液洗涤至无色.用超纯水洗涤至中性后,再用无水硫酸钠干燥一周,减压蒸馏,馏出液于恒温箱中4℃密封冷藏.

丙烯酰胺的精制:称50 g丙烯酰胺溶于40℃的20 mL超纯水中,置冰箱冷却结晶,用布氏漏斗过滤,自然晾干,在20～30℃下真空干燥24 h,保存于恒温箱中.

二甲基丙烯酸乙二醇酯的精制:取50 mL EGDMA加入质量分数10%NaOH溶液20 mL于分液漏斗中,用NaOH溶液分3次洗涤,再加入无水CaCl230 g,干过滤得精制品.

偶氮二异丁腈的精制:取质量分数95%乙醇50 mL加入磨口锥形瓶中,回流加热至沸腾,加入5 g偶氮二异丁腈,振荡至AIBN溶解,抽滤热溶液,在4℃下冷却结晶后,在干燥器中干燥,成品保存于棕色试剂瓶中.

超声波清洗机（SB-5200D型,宁波新芝生物科技股份有限公司）；电子天平（EL104型,梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；调速振荡器（HY-8型,常州国华电器有限公司）；数显恒温水浴锅（HH-6型,江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；紫外可见分光光度计（U-3010型,日本日立公司）；振荡混合器（S25型,德国IKA公司）；光照培养箱（YSEI型,重庆市永生实验仪器厂）.

2.2 实验方法

2.2.1 溶剂的选择实验 准确称取25 mg（为0.198 2 mmol）三聚氰胺于10 mL比色管中,分别加入用于分子印迹聚合物合成的常见溶剂5.0 mL,在调速振荡器上振荡2 h.以三聚氰胺的溶解速度相对较快和溶解数量较多为选择依据,确定所要选定的溶剂.

2.2.2 功能单体的选择实验 准确称取25 mg三聚氰胺于10 mL比色管中,按照三聚氰胺∶功能单体的物质的量比为1∶4的比例加入功能单体,再分别加入选定的溶剂5.0 mL.将混合液超声振荡30 min,室温下静置24 h后,移取0.1 mL混合液,用相应溶剂稀释至10 mL,以选定的溶剂为参比,在波长为200～400 nm范围内进行紫外吸收光谱扫描.

2.2.3 三聚氰胺分子印迹聚合物的制备 三聚氰胺分子印迹聚合物的合成采用本体聚合法与沉淀聚合法,制备对应的MIP和NIP.

1）本体聚合法.称取25 mg三聚氰胺于25 mL干燥的比色管中,加入10 mL优化选定的溶剂.按照三聚氰胺∶功能单体∶交联剂为1∶4∶20的物质的量比,加入功能单体和交联剂.首先加入功能单体后,超声波振荡30 min,在光照培养箱中恒温4℃预聚合24 h,再加入交联剂EGDMA和50 mg引发剂AIBN,超声波振荡15 min,通入纯氮除氧5 min,密封后于60℃恒温水浴下热聚合12 h.NIP除不加入Mel外,均按上述步骤操作.制备MIP和NIP各平行2次.将制备好的MIP与NIP于索氏提取器中除去未聚合的模板分子、功能单体、交联剂、引发剂和溶剂,以甲醇∶乙酸（体积比为9∶1）为模板分子洗脱剂,索氏提取8 h,用甲醇反复洗涤分子印迹聚合物以除去残留的乙酸,于80℃恒温干燥8 h后待用.

2）沉淀聚合法.称取25 mg三聚氰胺于100 mL干燥的碘量瓶中,加入10 mL优化选定的溶剂,再加入40 mL乙腈.其它操作同本体聚合法.

3）分子印迹聚合物的产率计算.用电子天平准确称量制得的分子印迹聚合物,分别按照下式计算分子印迹聚合物MIP与NIP的产率.

2.2.4 三聚氰胺与功能单体的结合实验 准确称取25 mg三聚氰胺于10 mL比色管中,按照功能单体∶三聚氰胺的物质的量比分别为0∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1的比例加入选定的功能单体,再分别加入选定的溶剂5.0 mL.将混合液超声振荡30 min,室温下静置24 h后,移取0.1 mL混合液,用相应溶剂稀释至10 mL,以选定的溶剂为参比,在波长为200～400 nm内进行紫外光谱扫描.

3 结果与讨论

3.1 溶剂的选择三聚氰胺属于三嗪类杂环化合物,呈弱碱性,在常见的有机溶剂中溶解度较小.三聚氰胺难溶于氯仿、丙酮等低极性溶剂,文献资料表明在甲醇中溶解性能较二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等要好［14］,以甲醇为溶剂可避免溶剂与三聚氰胺间形成的氢键,干扰单体与三聚氰胺的结合.以二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙腈、丙酮、乙醇、水为溶剂进行溶解性对比实验,结果发现三聚氰胺在甲醇为溶剂中的溶解度较大,可以达到5.0 g/L,溶解速度较快,能满足分子印迹过程对模板分子溶解度的要求.实验选择甲醇为分子印迹聚合物制备过程中的溶剂和致孔剂.

3.2 功能单体的选择采用紫外光谱法比较模板分子三聚氰胺与 AA、AM、MAA、OPA、MMA 5种功能单体相互结合的紫外吸光度,数据表明:三聚氰胺与AM有最大的紫外吸光度差值（见表1）.

表1 三聚氰胺与功能单体结合的紫外吸光度Table 1 UV adsorption degree between Mel and different functional monomers

分析Mel与AM相互作用的紫外吸收光谱图,可以得知:三聚氰胺的最大吸收峰在222 nm处,功能单体的最大紫外吸收波长在230 nm,丙烯酰胺与三聚氰胺的最大紫外吸收波长相接近.丙烯酰胺与三聚氰胺混合后的紫外光谱扫描曲线表明,最大紫外吸收波长在236 nm,紫外吸光度与混合前相比较发生了很大改变.Mel-AM-Met的紫外吸光度远大于AM-Met与Mel-Met紫外光谱相叠加的紫外吸光度,表明2种溶液混合后的紫外吸光度不是两者的简单叠加,而是2种溶液经分子间的自组装作用形成了新物质分子的紫外光谱.

功能单体与模板分子间,当两者最大紫外吸光度相差越大,说明功能单体与模板分子的作用越强［15-16］,从表 1 中可以得出,与 AA、MAA、OPA、MMA相比较,丙烯酰胺与三聚氰胺的相互作用更强,用于合成三聚氰胺分子印迹聚合物,理论上分析AM是较为理想的功能单体.所以,实验选择AM为合适的功能单体.

3.3 分子印迹聚合物的产率计算以选择的溶剂和功能单体,交联剂选择二甲基丙烯酸乙二醇酯,引发剂选择偶氮二异丁腈,合成了三聚氰胺分子印迹聚合物,其产率计算见表2.

从表2可以得出,本体聚合法的分子印迹聚合物产率普遍高于沉淀聚合法.沉淀聚合法的MIP与NIP分子印迹聚合物产率的平均值分别为57.48%和58.85%,本体聚合法的MIP与NIP产率平均值分别为91.35%和92.71%.但是本体聚合制得大块状分子印迹聚合物,需要经过粉碎、研磨、筛分、反复沉降处理制得一定颗粒直径的粉末材料,过程繁琐,得率较低,所以一般采用沉淀聚合法制备分子印迹聚合物.2种聚合法所得到的MIP聚合物产率的平均值都略低于NIP,从分子印迹聚合物合成上分析,可能是聚合物经过索氏提取洗涤时间充分,将MIP中游离的Mel、AM等完全洗脱去除有关.

表2 三聚氰胺分子印迹聚合物的产率计算Table 2 The calculation of productive rate for MIP and NIP of Mel

表3 三聚氰胺与丙烯酰胺的分子结合比例研究数据Table 3 The recognition mechanism data between Mel and AM molecules

表4 三聚氰胺与丙烯酰胺的分子结合比例与结合常数Table 4 The molecular binding ratio and constant between Mel and AM molecules

3.4 三聚氰胺与功能单体的结合模板分子三聚氰胺与功能单体丙烯酰胺的结合机理通过差示紫外光谱进行研究,可以得知三聚氰胺与丙烯酰胺的分子结合比例以及分子间反应的结合常数.由于AM的浓度b0即［AM］,远大于三聚氰胺的浓度a0,根据文献［17］,Mel与AM的结合反应公式可推导和整理得如下表达式:△A＝-K△A+K△ξcla0,式中△A为差示吸光度；K表示Mel与AM结合反应的结合常数；△ξcla0为结合物的组成；n为Mel与AM的分子结合比例,取正整数.

用表3中的数据以对 Δ A作图,得到图1、图2和表4.结果发现,当n＝3时,其回归方程为＝-492 780△A+374 290 R＝0.910 6,可得到＝-K△A+K△ξcla0.式中的拟合斜率k和结合常数K的绝对值都为4.93×105,三聚氰胺与丙烯酰胺主要以氢键结合,三聚氰胺与丙烯酰胺的分子结合比例为1∶3.n＝4时,可由图2求得拟合斜率k和结合常数K的绝对值都为1.0×108,虽然结合常数K值较大,但从分子结构上进行分析,三聚氰胺分子结构中—NH2上N—H键的H可与丙烯酰胺中的氨基氮和羰基氧以氢键结合,形成3个很稳定的6元环,如图3所示.

从分子结构上看这种结合方式最为稳定,可推测三聚氰胺和丙烯酰胺之间通过氢键形成了1∶3型的结合物.以分子结合比例研究和分子结构分析2种方法均得到三聚氰胺与丙烯酰胺之间分子结合比例都为1∶3的结论,正是三聚氰胺在其分子印迹聚合物中的选择性分子识别机理.

4 结论

以三聚氰胺为模板分子,实验选择甲醇作为溶剂和致孔剂、丙烯酰胺作为功能单体.采用沉淀聚合法和本体聚合法制备了三聚氰胺分子印迹聚合物,本体聚合法制备所得MIP与NIP聚合物产率的平均值高于沉淀聚合法,但沉淀聚合法制备的分子印迹聚合物易分离,无须碾磨过筛,吸附性能较好,因此,选择沉淀聚合法为较优合成方法.三聚氰胺与丙烯酰胺之间主要以氢键形成1∶3型结合物,产生特异性的选择性分子识别,结合常数K达到4.93×105,表明分子印迹聚合物结构稳定.

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