翁琴云+++游小伟+++张建梅+++黄建炜

[摘要] 目的 建立厦门市副溶血性弧菌分离株的脉冲场凝胶电泳（PFGE）数据库，分析不同来源菌株的同源性关系。 方法 203株菌株的基因组DNA经SfiⅠ酶切、脉冲场电泳后，利用Bionumerics软件分析电泳图谱。 结果 203株菌株可分成149种不同的PFGE型，91.13%（185株）的菌株具有独特的带型，同时也有少数带型包含的菌株数较多。对于日常监测中分离得到的菌株，PFGE分型结果与水产品的种类、采样时间基本无相关性，79个菌株可分成74个PFGE带型；从历年食物中毒应急监测中分离得到的菌株，其PFGE型相对较少，124株中只有76个PFGE型。应用Bionumerics计算D值为99.81%。 结论 建立了厦门市副溶血性弧菌的PFGE数据库，为本市副溶血性弧菌的监测和疫情的应急处理提供了科学依据。

[关键词] 副溶血性弧菌；脉冲场凝胶电泳；分子分型

[中图分类号] R378.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）08（a）-0007-04

Molecular analysis and database establishment of Vibrio parahaemolyticus by pulsed field gel electrophoresis in Xiamen

WENG Qin-yun YOU Xiao-wei ZHANG Jian-mei HUANG Jian-wei

Center for Disease Control and Prevention of Xiamen City，Xiamen 361021，China

[Abstract] Objective To establish pulsed field gel electrophoresis（PFGE）database of Vibrio parahaemolyticus and to analyse the homology during the strains from different sources. Methods The DNA samples of 203 Vibrio parahaemolyticus strains were digested with SfiⅠand then were analyzed by PFGE and bionumerics software. Results 203 strains were divided into 149 distinctive PFGE patterns 91.13% （185 strains） of strains owned unique PFGE pattern，and a few of strains owned more strains.79 strains from surveillance were divided into 74 PFGE patterns，which indicated that there was no relationship between the typing results and aquatic product，sampling time.124 strains from food poisoning were divided into 76 PFGE patterns.The D value was 99.81% calculated by bionumerics software. Conclusion The PFGE database of Vibrio parahaemolyticus in Xiamen is established，which providing scientific basis for surveillance and emergency response of Vibrio parahaemolyticus in the city.

[Key words] Vibrio parahaemolyticus；Pulsed field gel electrophoresis；Molecular typing

副溶血性弧菌是一种嗜盐性革兰氏阴性弧菌，广泛存在于海水和海产品中，进食含有该菌的食物，可引起严重的胃肠炎反应[1]，目前是我国沿海地区常见的食物中毒病原菌。脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）技术是一种非常重要且应用广泛的分子分型技术，可用于评价副溶血性弧菌菌株之间的遗传多样性及来源于环境的菌株与分离自患者菌株的相关性[2-3]。厦门地处沿海，在食源性致病菌日常监测中经常可从外环境各种水体和水产品中分离到副溶血性弧菌菌株，同时在本地暴发的多起食物中毒应急检测中分离得到副溶血性弧菌菌株。本项目采用PFGE技术对本实验室历年从日常检测与食物中毒应急事件中分离得到的203株副溶血性弧菌菌株进行分析研究，建立厦门市副溶血性弧菌PFGE数据库，有利于从分子水平上了解本市副溶血性弧菌的环境菌株与分离自患者菌株的特征及其相互关系。

1 材料与方法

1.1 菌株

2005年5月～2012年11月本实验室在日常监测及食物中毒中分离得到的203株副溶血性弧菌分离株，其中有79株是在日常监测中分离得到，另外124株是在历年的食物中毒应急检测中分离得到。

1.2 主要试剂和仪器

蛋白酶K（Merck公司）；脉冲场电泳级琼脂糖SeaKem Gold Agarose（Lonza公司）；限制性内切酶：SfiⅠ、XbaⅠ（NEB公司）；脉冲场电泳仪为CHEF MAPPER（Bio-Rad公司）；Densimat细菌浊度仪（BioMerieux公司）；凝胶成像仪为Gel Doc XR+（Bio-Rad公司）。

1.3 实验方法

根据PulseNet网络实验室推荐的标准方法进行PFGE实验。

1.3.1 胶块制备 从检测培养基上挑取单菌落，无菌接种于3% TSA平板上，37℃培养14～18 h。从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于细胞悬浮液（CSB）中于浊度仪上调整细菌的浓度，使OD值为4～4.5。取400 ml菌悬液加入终浓度为0.5 mg/ml蛋白酶K进行消化，再加入等体积1% SeaKem Gold Agarose，混匀灌制胶块。

1.3.2 细胞裂解和胶块的洗涤 凝固后胶块加入细胞裂解液（CLB）/蛋白酶K混合液，置于54℃水浴轻摇2 h后，用50℃预热的灭菌超纯水洗涤2次，再用50℃预热TE缓冲液洗涤4次。

1.3.3 胶块DNA酶切 切取2 mm宽的副溶血性弧菌胶块，用SfiⅠ酶处理，于50℃酶消化4 h，沙门菌H9812用XbaⅠ酶切，于37℃酶消化4 h。

1.3.4 加样和电泳 将酶切后的胶块直接粘在梳子齿上，向胶槽中注入100 ml溶化的1% SeaKem Gold Agarose，待胶凝固后进行电泳。设置电泳缓冲液的温度为14℃，电泳参数：78～396 kb、10～35.3 s、19 h。

1.3.5 图像获取及数据分析 电泳结束后，将胶放入Gelred染料中染色，脱色后用Gel Doc XR+成像，使用BioNumerics（6.6.4）软件，选择Dice相关系数和UPGMA方法，设置tolerance为1.5%，对PFGE图谱进行处理和聚类分析。同时，使用Simpson差异指数（D值）对PFGE分型结果进行评价。本实验中的菌株带型均按照国际PulseNet的带型命名原则进行命名。

2 结果

2.1 PFGE分型结果

203株副溶血性弧菌经过PFGE分析，获得149个不同的PFGE带型，命名为VPAS12.XM0001～VPAS 12.XM0149。图1是每个PFGE型各选取1个代表株的聚类图，可看出DNA条带分子量主要集中于30～700 kb，酶切条带数为14～21。优势型别有VPAS12.XM0105，共含有14个菌株；VPAS12.XM0124含有8个菌株；VPAS12.XM0113、VPAS12.XM0121、VPAS12.XM0125，都含有6个菌株；VPAS12.XM011有4个菌株。优势型别所含有的绝大多数菌株都是从食物中毒应急检测中分离得到，只有VPAS12.XM0105中有1个菌株来源于日常监测。应用Bionumerics计算D值为99.81%。

2.2 对厦门副溶血性弧菌的PFGE数据库总体描述

将本实验中所获得的203株副溶血性弧菌的PFGE图谱，全部录入Bionumerics软件中，建立了厦门市副溶血性弧菌的PFGE数据库。整个数据库共包含79株从日常监测中分离得到菌株及124株从历年食物中毒应急检测中分离得到的菌株，共获得149个PFGE型别，其中91.13%（185株）的菌株具有独特的带型，同时也有少数带型包含的菌株数较多，含有最多菌株（14株）的优势型别只有VPAS12.XM0105（图2）。

图2 各种PFGE带型包含的菌株数分布情况

从菌株来源看，对于日常监测中分离得到的菌株，PFGE分型结果与水产品的种类、采样时间基本无相关性，79个菌株可分成74个PFGE带型，各带型包含的菌株数最多3个菌株。对于从历年食物中毒应急监测中分离得到的菌株，其PFGE型相对较少，124株中只有76个PFGE型，各带型包含的菌株数最多13个菌株（表1）。

表1 副溶血性弧菌2种不同来源的菌株PFGE带型的情况描述

3 讨论

应用传统的血清型分型和噬菌体分型方法对副溶血性弧菌进行分型，只能进行表型鉴定，存在分辨力、灵敏度不高等诸多缺陷[4]，PFGE分型方法是一种基于基因水平的分子分型方法，因其具有高分辨力、可重复性、稳定性等特点，目前已成为分子分型的“金标准”。1996年在美国首先成立的PulseNet网络就是利用标准化的分子分型技术（PFGE技术是其中最重要的方法之一），通过菌株“指纹图谱”或序列资料的比对分析，识别传染病病例间的内在遗传关联，进而追溯传染病暴发来源和传播途径[5]。美国PulseNet成立之后，多次对以食源性病原体为主的细菌进行监测，且在多次食物中毒的调查中发挥了良好作用[6-8]。PulseNet China自2004年成立之后，也先后参与国内外多个疫情的协查与处理[6]，因此，本研究在预防和控制突发食源性疾病公共卫生事件中意义重大。

本项目中203株菌株可分成149种不同的PFGE型，91.13%（185株）的菌株具有独特的带型，同时也有少数带型包含的菌株数较多，但包含最多的优势型别VPAS12.XM0105，也只含有14个菌株，其中只有1个菌株是来源于日常监测。79个菌株可分成74个PFGE带型，各带型包含的菌株数最多3个菌株。众多型别的出现，说明了从日常监测中得到的厦门地区副溶血性弧菌菌株存在遗传多样性，而且变异度较大，与相关报道结果一致[2，9-10]。个别菌株间存在同源性，其中FJXM11VPA004和FJXM11VPA006图谱完全相同，属于同一个带型，命名为VPAS12.XM0096。这两个菌株采样时间、采样地点、采样种类都不一样，提示可能有相同的污染来源，所以仍应加强对副溶血性弧菌的日常监测，从而有效预防食源性疾病的发生。对于从历年食物中毒应急监测中分离得到的124株菌株，其聚类分析结果表明，各个菌株之间的相似度较高，总的可分成76个PFGE型，同一次食物中毒应急检测中分离得到的菌株，其指纹图谱大多数一致或高度相似，但也有的指纹图谱相差较大，这与食物中毒是由单一血清型感染或多血清感染具有很大关系。研究表明，食物中毒中同一患者分离到多种血清型，不同患者分离到不同种血清型[11-12]或剩余食品和患者可以分离到不同血清型的副溶血性弧菌均有可能[13-14]。

从菌株来源来看，79株从日常监测中分离得到的菌株与124株从历年食物中毒事件中分离得到的菌株，两者的菌株指纹图谱总体上存在显著差异，只有1个从日常监测中分离得到的菌株与食物中毒的菌株一致，可见，这些在日常监测中分离得到的副溶血性弧菌与本地暴发的疫情无关。

[参考文献]

[1] Wong HC，Lin CH.Evaluation of typing of Vibrio parahaemolyticus by three PCR methods using specific primers[J].J Clin Microbiol，2001，39（12）：4233-4240.

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[5] 李伟，崔志刚，阚飙，等.转化预防医学的实践：PulseNet-China[J].疾病监测，2012，27（2）：88-92.

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[9] 侯凤伶，刘维华，申志新，等.副溶血性弧菌脉冲场凝胶电泳分型研究[J].实用预防医学，2008，15（1）：34-37.

[10] Wong HC，Liu SH，Chiou CS，et al.A pulsed-field gel electrophoresis typing scheme for Vibrio parahaemolyticus isolates from fifteen countries[J].Int J Food Microbiol，2007，114（3）：280-287.

[11] 黄锐敏，俞慕华，鞠长燕.一起副溶血性弧菌引起的食物中毒病原学分析[J].河南预防医学杂志，2011，22（2）：151-152.

[12] 方叶珍，黄世旺，罗芸，等.一起两种血清型副溶血性弧菌食物中毒的毒力基因及分子分型研究[J].中国卫生检验杂志，2012，22（1）：96-98.

[13] 林秋云，曾树权，尹映华，等.一起副溶血性弧菌引起食物中毒的实验室检测[J].中国微生态学杂志，2012，24（2）：178-180.

[14] 邓冬云，梁景涛，杨启，等.多型别副溶血性弧菌引起的食物中毒病原学分析[J].中国卫生检验杂志，2012，22（4）：776-778.

（收稿日期：2014-05-07 本文编辑：李亚聪）

从菌株来源来看，79株从日常监测中分离得到的菌株与124株从历年食物中毒事件中分离得到的菌株，两者的菌株指纹图谱总体上存在显著差异，只有1个从日常监测中分离得到的菌株与食物中毒的菌株一致，可见，这些在日常监测中分离得到的副溶血性弧菌与本地暴发的疫情无关。

[参考文献]

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[14] 邓冬云，梁景涛，杨启，等.多型别副溶血性弧菌引起的食物中毒病原学分析[J].中国卫生检验杂志，2012，22（4）：776-778.

（收稿日期：2014-05-07 本文编辑：李亚聪）

从菌株来源来看，79株从日常监测中分离得到的菌株与124株从历年食物中毒事件中分离得到的菌株，两者的菌株指纹图谱总体上存在显著差异，只有1个从日常监测中分离得到的菌株与食物中毒的菌株一致，可见，这些在日常监测中分离得到的副溶血性弧菌与本地暴发的疫情无关。

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[11] 黄锐敏，俞慕华，鞠长燕.一起副溶血性弧菌引起的食物中毒病原学分析[J].河南预防医学杂志，2011，22（2）：151-152.

[12] 方叶珍，黄世旺，罗芸，等.一起两种血清型副溶血性弧菌食物中毒的毒力基因及分子分型研究[J].中国卫生检验杂志，2012，22（1）：96-98.

[13] 林秋云，曾树权，尹映华，等.一起副溶血性弧菌引起食物中毒的实验室检测[J].中国微生态学杂志，2012，24（2）：178-180.

[14] 邓冬云，梁景涛，杨启，等.多型别副溶血性弧菌引起的食物中毒病原学分析[J].中国卫生检验杂志，2012，22（4）：776-778.

（收稿日期：2014-05-07 本文编辑：李亚聪）