李家敏+姜琼+汪剑鸣

摘要:采用改良CTAB法提取广东紫珠(Callicarpa kwangtungensis Chun.)植物总DNA,以通用引物ITS4和ITS5 PCR扩增核糖体DNA ITS序列,并运用MEGA5.2软件分析ITS序列和构建系统发育树。结果表明,广东紫珠的核糖体DNA ITS序列长度为658 bp,ITS1和 ITS2的长度分别为229、267 bp,G+C含量分别为67.39%、70.30%。用NJ法根据ITS1与ITS2序列构建系统发育树,ITS片段在种间存在差异,可区分紫珠属中不同的种。测序分析和系统发育树构建,能够对广东紫珠进行准确的分子鉴定,为紫珠属中药材的种类鉴定和种间的分类地位提供分子生物学理论依据。

关键词:广东紫珠(Callicarpa kwangtungensis Chun.);ITS序列;分子鉴定

中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:0439-8114(2014)10-2435-05

Identification of Callicarpa kwangtungensis Chun. with ITS Sequences

of Nuclear Ribosomal DNA

LI Jia-min,JIANG Qiong,WANG Jian-ming

(College of Chemical and Biological Engineering,Yichun University,Yichun 336000,Jiangxi,China)

Abstract: To identify C.kwangtungensis Chun. with ITS of rDNA, the total DNA of the sample was extracted with modified CTAB. The ITS of rDNA was amplified using a pair of primers ITS4 and ITS5 then was cloned, sequenced and analyzed by MEGA5.2. The results showed that the length of ITS of rDNA was 658 bp. The DNA sequence of ITS4 was 229 bp with the content of G+C of 67.39%. The DNA sequence of ITS5 was 267 bp with the content of G+C of 70.30%.The phylogenetic tree based on ITS data was constructed. Molecular identification could be performed on Callicarpa kwangtungensis Chun. It will provid molecular evidence for taxonomy and identification of different species of Callicarpa.

Key words: Callicarpa kwangtungensis Chun.;ITS sequences;molecular identification

基金项目:江西省教育厅青年基金项目(GJJ10252);江西省天然药物活性成分研究重点实验室开放基金项目

广东紫珠(Callicarpa kwangtungensis Chun.)为马鞭草科紫珠亚属多年生落叶植物,适合生长于海拔100~1 000 m的丘陵山地,主要分布于江西、湖南、福建、贵州等省,广东和广西等地也有少量分布。广东紫珠的干燥茎、枝、叶均可入药,具有收敛止血、清热解毒等功效,收载于《中国药典》(2010年版),可用于治疗咯血、便血、肺胃出血、崩漏、肺热咳嗽、咽喉肿痛、烧伤、热毒疮、外伤出血等。化学成分研究表明,广东紫珠富含熊果酸、槲皮素、没食子酸、水杨酸等化学成分[1];药理研究显示具有较强的抑菌作用和显著的止血效果[2],临床上广东紫珠主要用于治疗宫颈糜烂出血、阴道炎、宫颈炎等,是抗宫炎片、抗宫炎颗粒和抗宫炎胶囊等中成药的主要成分[3]。目前,市场上对广东紫珠资源需求量很大,原料药材供不应求,由于大量采挖,野生资源锐减,且遭到严重破坏,加上野生药材质量难以控制,野生资源已不能满足社会需求,对广东紫珠进行资源鉴定和育种成为解决这一问题的关键。准确鉴定广东紫珠有利于指导其育种,因此,有必要在DNA分子水平上鉴定广东紫珠与其他紫珠属植物的种间关系。ITS(Internal transcribed spacer,ITS)序列是核糖体DNA转录单位的一部分,包括了ITS1、ITS2和5.8S rDNA基因,在被子植物中ITS序列既具有核苷酸序列的保守性和高度变异性。ITS序列分析是近年来国际上植物多样性研究的热点,并在药用植物种质资源研究中得到广泛应用,如药用植物品种的鉴定、亲缘关系鉴定、药用植物分类、遗传多样性、药用植物DNA条形码分析等[4]。本研究采用ITS序列标记对广东紫珠的核糖体DNA ITS序列进行分子鉴定,构建其系统发育树,从DNA水平上为广东紫珠的地位分类和种间鉴定提供分子证据和为广东紫珠的选育提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

广东紫珠于2013年3月采集自江西省宜春市,经宜春学院化学与生物工程学院汪剑鸣教授鉴定为马鞭草科紫珠属广东紫珠,保存于江西省天然药物活性成分研究重点实验室。

1.2主要试剂与仪器

NaCl、CTAB、EDTA、Tris、氯仿、异戊醇、异丙醇均为分析纯,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,PCR反应试剂购自于宝生物工程(大连)有限公司。总CTAB提取缓冲液为2.5 mol/L NaCl、2% CTAB(W/V)、0.05 mol/L EDTA、0.1 mol/L Tris[5]。

超低温冰箱(7010702)、水浴锅(HH-4)、离心机(Eppendorf-G5415R)、XP基因扩增仪(BYQ602101-174)、双稳定时电泳仪(DYY-6C)、紫外分光光度计(UV-2000)、凝胶成像系统(Gel Media System)。

1.3方法

1.3.1广东紫珠总DNA的提取新鲜幼嫩叶片,清水冲洗,后以体积分数为70%的乙醇消毒,去离子水冲洗3次,于-80 ℃冰箱保存。取0.2 g叶片组织用液氮研磨成粉末,放入1.5 mL离心管中;加入600 μL 65 ℃预热的CTAB提取缓冲液,轻轻摇匀,65 ℃水浴60 min,期间轻晃3次;再加700 μL氯仿-异戊醇(体积比24∶1),轻轻颠倒混匀10 min,10 000 r/min离心10 min,转移上清液至另一新管中;加入等体积-20 ℃预冷的异丙醇混匀,-20 ℃放置30 min,10 000 r/min离心15 min,弃上清液,70%的乙醇沉淀,无水乙醇洗涤,室温挥干乙醇;以去离子水在4 ℃下溶解DNA,-20 ℃保存。

1.3.2核糖体DNA ITS区片段的PCR扩增采用核糖体DNA ITS序列通用引物扩增整个ITS片段(ITS1-5.8S rDNA-ITS2区段),ITS4:5′-TCCTCCGC

TTATTGATATGC-3′,ITS5:5′-GGAAGGAGAAGTC

GTAACAAGG-3′[6]。PCR反应体系:10×PCR Buffer 5 μL,MgCl2(25 mmol/L)4 μL, dNTPs(2 mmol/L) 5 μL,ITS4与ITS5引物各5 μL(1 μmol/L),Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)1 μL,DNA模板(约70~80 ng)5 μL,ddH2O 20 μL。PCR反应程序为:95 ℃预变性4 min;95 ℃变性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,35个循环;72 ℃延伸5 min,PCR产物以1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测。PCR产物用TaKaRa Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction kit Ver.3.0(宝生物工程有限公司)进行纯化,按照说明书操作。

1.3.3核糖体DNA ITS序列的克隆与测序将纯化后的PCR产物克隆至大肠杆菌pMD 18-T载体上,经氨苄青霉素抗性筛选后,将所得菌落接种到LB液体培养基(含氨苄青霉素)上进行过夜培养,提取质粒进行PCR扩增,以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,并将阳性菌株送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.3.4核糖体DNA ITS序列分析DNA序列使用MEGA5.2软件进行分析,采用Pairwise distances法计算遗传距离,采用NJ邻接法构建紫珠属多个物种的NJ系统发育树;系统发育树各分支的置信度用自举检验法(Bootstrap test)检验,共进行2 000次循环,以评价各分支的系统学意义与可靠性

2结果与分析

2.1广东紫珠总DNA提取结果

将提取的总DNA稀释200倍后,取5 μL样品,以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图1所示。不同样本DNA的电泳带均有清晰明确的目的条带,无降解现象,样本DNA质量比较稳定。

2.2 核糖体DNA ITS PCR扩增结果

以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,结果如图2所示。由图2可以看出,PCR扩增产物条带明亮,片段完整,分子量约750 bp左右,与报道中ITS片段大小相符。将PCR扩增产物进行切胶,并用试剂盒(TaKaRa Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0)进行回收。

2.3核糖体DNA ITS序列分析

用MEGA5.2软件对核糖体DNA ITS序列进行分析,以来源于英国皇家植物园的紫珠属植物Callicarpa japonica的核糖体DNA ITS序列(FM163230)作为参比序列,进行序列拼接,结果如图3所示。广东紫珠的核糖体DNA ITS片段长度为658 bp,ITS1长为229 bp,G+C含量为67.39%;5.8S rDNA长为162 bp;ITS2长为267 bp,G+C含量为70.30%。

由于5.8S rDNA序列比较保守,本研究仅分析ITS序列。将样本的ITS序列与在GenBank中已提交的紫珠属物种的ITS序列(表1)进行多序列BLAST比对分析。多序列同源比对后的ITS长度为513 bp,保守位点为428个,占83.43%;变异位点76个,占14.84%,序列比对中Callicarpa japonica的核糖体DNA ITS序列与其他物种的ITS序列出现9 bp缺失(图4);简约信息位点25个,占4.87%,单个位点50个,占9.75%。ITS1的变异位点为32个,简约信息位点数为12个,ITS2的变异位点数44个,简约信息位点数13个。本试验结果与厚朴的ITS序列变异趋于一致[7]。从序列比对可见,ITS序列发生了碱基的替换,ITS2发生次数更多,同时在ITS2区域,发生了碱基的1个、3个、4个的缺失,而ITS1出现缺失相对少。可见,就变异位点而言,ITS2序列所含信息量高于ITS1。

2.4基于ITS序列的紫珠属亲缘关系分析

由于核糖体DNA ITS中ITS1和ITS2两个片段长度有限,各自提供的信息量有限,因此,多数研究者将两个片段综合起来分析。因此,将样本广东紫珠的ITS序列与紫珠属物种的ITS序列通过序列对比,利用MEGA 5.2软件基于Pairwise distances(p-distances)计算样本的遗传距离如表2所示。11个紫珠属样本的遗传距离介于0.022~0.088,广东紫珠与日本紫珠(FM163230)的遗传距离最近,为0.028,与Callicarpa pentandra(FM163237)的遗传距离最远,为0.080。

根据样本的ITS序列采用NJ法构建系统发育树,如图5所示,11个样本被分为两支。一支为木紫珠(FM163233)、Callicarpa pentandra(FM163237)与白毛紫珠(AF478942)聚为一支,另一支由8个种组成,其中红紫珠(FM163231)、老鸦糊(FJ593347)、日本紫珠(FM163230)被聚为一支,然后广东紫珠再与其聚为一亚支;狭叶红紫珠(FM163240)、大叶紫珠(FM163246)、长叶紫珠(FM163252)聚为一亚支;白棠子树(FM163242)与以上两亚支聚为一支,说明以上紫珠属种的遗传距离相近,从分子水平上支持了广东紫珠的分类地位。

3小结与讨论

核糖体DNA ITS序列能成为被子植物系统与进化研究中的重要分子标记。 ITS片段作为18S~26S rDNA的一个组成部分在核基因组中是高度重复的,通过不等交换和基因转换,不同ITS拷贝间的序列趋于相近或完全一致,为PCR 扩增产物直接测序奠定了理论基础[8]。ITS1和ITS2作为非编码区,承受的选择压力较小,其长度保守,但核苷酸序列变化大,可提供详尽的遗传学信息[9],同时ITS序列长度比较稳定,包括5.8S rDNA在内,总长度只有600~700 bp,为测序带来了很大方便。核糖体DNA ITS已被广泛地应用到中药植物的鉴定研究中,如当归、牛蒡子、钩藤等中药植物的鉴定[10-12]。

广东紫珠的ITS序列片段总长为658 bp,其中G+C含量较高,相同现象出现在柳属物种上[13];ITS的变异位点中,ITS2变异位点比例、信息量高于ITS1,结论与不同产区厚朴的ITS序列分析结果一致[7];在紫珠属物种中ITS1、ITS2的变异都有碱基替换外,但ITS2还出现多个碱基缺失,ITS2片段的差异可用于紫珠属种间鉴定。

根据植物形态区分,广东紫珠与日本紫珠(FM163230)属于紫珠亚属的孔裂药系,其他9个样本属于纵裂药系。基于ITS基因序列的系统聚类而言,广东紫珠与日本紫珠遗传距离最近,聚类结果与形态学分类不一致,可作为广东紫珠系统发育的支持。作为重要原料药,广东紫珠资源不足,市场上采用大叶紫珠(FM163246)代替,两者在形态上有一定差异[14],ITS序列分析结果表明,两者遗传距离0.038,聚类分析不在一分支,表明采用ITS序列能很好将两者分开,但仅根据凭ITS序列研究紫珠属种系关系是不够全面的,有关其系统分类与亲缘关系的研究尚结合其他DNA分析手段做出更科学的评价。

致谢:本研究得到江西省普通本科高校中青年教师发展计划访问学者专项支持,中国药科大学中药学院陆续博士在数据分析中给予指导,在此一并致谢。

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