吴家飞+李晓宇+范咏梅+柳志强

摘要：从南酸枣（Choerospondias axillaris）中分离到一株对芒果炭疽病菌拮抗作用较强的菌株WYG5，皿内拮抗活性达32%，通过形态观察、生理生化测定及16S rDNA序列分析，将该菌株鉴定为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），经测定该菌株发酵液及发酵滤液对采后芒果均有显著的保鲜防病效果，处理9 d后的防效分别为60.76%和59.50%，12 d后的防效分别为43.59%和34.19%。

关键词：南酸枣；内生细菌；芒果炭疽病菌；防治效果

中图分类号：Q939.95文献标识码：A文章编号：0439-8114（2014）10-2398-03

Identification of Choerospondias axillaris Endophytic Bacterial Strain WYG5 and Its Effects on Preservating Postharvest Mango

WU Jia-fei，LI Xiao-yu，FAN Yong-mei，LIU Zhi-qiang

（College of Environment and Plant Protection，Hainan University，Haikou 570228，China）

Abstract：Strain WYG4，isolated from Choerospondias axi11aris（Roxb1） Burttet Hill，had higher antagonistic effects against Colletotrichum gloeosporioides， with antagonistic activity of 32% in plate. According to its morphological，physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence，the strain WYG5 was identified as Bacillus megaterium. Its fermentation broth and fermentation filtrate had obvious effects on preservating postharvest mango. After 9 d and 12 d treatment，the controlling effects were up to 60.76%， 59.50% and 43.59%，34.19%， respectively.

Key words：Choerospondias axillaris； endophytic bacteria； Colletotrichum gloeosporioides； control effect

基金项目：国家自然科学基金项目（31160377）；国家科技支撑计划项目（2012BAK01B05）

南酸枣（Choerospondias axillaris）为漆树科南酸枣属落叶大乔木，多年生，又名五眼果、酸枣树、山枣子等，主要分布于云南、广东、广西、湖南、湖北、江西、福建、浙江、贵州等地区[1]，其树皮和果实可以入药，树皮主治疮疡、汤火伤、阴囊湿疹；鲜果则消食滞，治食滞腹痛；果核醒酒解毒，治风毒起疙瘩成疮或疡痈[2]。

植物内生菌是指在其生活史的一定阶段生活在活体植物组织内，而不引起植物明显病害的微生物[3]。许多研究表明植物中的内生细菌对宿主具有抗病促生的能力，作为生物菌剂在生物防治方面和促进植物生长方面有着重要的应用价值[4，5]。试验从南酸枣体内分离出一株内生细菌WYG5，发现其对芒果炭疽病菌具有较好的拮抗效果，利用常规方法结合16S rDNA序列分析对该菌株进行了鉴定，并测定了其对采后芒果的保鲜防病效果，为其今后应用奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试材料南酸枣采自海南大学儋州校区，内生细菌WYG5从南酸枣中经组织表面消毒分离获得。芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz）由海南大学环境与植物保护学院提供，芒果品种为台农l号。

1.1.2培养基LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g，去离子水1 L；PDA培养基：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 20 g，去离子水1 L。

1.2方法

1.2.1菌株培养菌株WYG5经活化后接入LB培养基，37 ℃、180 r/min 振荡培养2 d，收集发酵液，12 000 r/min离心5 min，将上清液利用0.22 μm的滤膜除菌过滤，得到发酵滤液。

1.2.2 菌株WYG5的鉴定采用常规鉴定方法进行[6]。菌株基因组DNA利用Bacterial DNA Kit（50）试剂盒提取，利用16S rDNA通用引物（5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进行基因扩增，由上海英骏生物技术有限公司进行序列测定，将所测序列在GenBank中进行Blast分析，根据Blast结果利用MEGA 5.0软件以邻近相接法构建系统进化树。

1.2.3菌株WYG5皿内拮抗活性测定 在直径9 cm的PDA平板中央接种1块直径为5 mm芒果炭疽病菌的菌饼，菌丝面朝下，同时在菌饼两侧2 cm处各接入一环内生细菌WYG5，以不接内生细菌为对照，每处理3次重复，28 ℃培养2～3 d，十字交叉法计算皿内拮抗活性。

1.2.4菌株WYG5对芒果的防病效果取健康无病、大小均一、约八成熟芒果果实，用75%酒精表面消毒后，自然晾干备用。处理液包括发酵液、10倍稀释发酵液、发酵滤液、10倍稀释发酵滤液，以去离子水处理为对照。处理时将果实分别于各处理液中浸泡10 min，晾干后装入保鲜盒中放置，在处理后第6、9、12 天共调查3次，逐次记录并累加炭疽病病果数和病级，计算病指和防效，并对防效进行方差分析。具体方法参照国家标准GB/T 17980.98-2004进行。

果实发病程度分级方法如下，0 级：无病；1 级：病斑面积占果实面积的5%以下；3 级：病斑面积占果实面积的 6%～15%；5 级：病斑面积占果实面积的 16%～25%；7 级：病斑面积占果实面积的 26%～50%；9 级：病斑面积占果实面积的 50%以上。试验数据采用DPS处理，进行差异显著性分析。

病情指数= [∑（各级病果数×相对级数）/（调查总果数×9）]×100

防效=[（对照区病情指数-处理区病情指数）/对照病情指数]×100%。

2结果与分析

2.1菌株WYG5的鉴定

菌株WYG5在培养基上菌落呈圆形，浅黄色，边缘整齐，表面有凸状隆起，干燥，不透明，革兰氏染色阳性，芽孢染色阳性，菌体杆状，周生鞭毛。菌株WYG5 的形态和生理生化特征与东秀珠等[6]描述的巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）特征相同。对菌株WYG5的16S rDNA序列进行PCR扩增，产物经纯化后测序，得到 1 515 bp的碱基序列。将16S rDNA 序列进行BLAST分析，发现它与多株巨大芽孢杆菌菌株的同源性均在99%以上。选取GenBank中的8株芽孢杆菌属的细菌与菌株WYG5一起，利用软件MEGA 5.0构建出基于16S rDNA序列的系统发育树（图1）。由图1可以看出，菌株WYG5与巨大芽孢杆菌的同源性最高，结合形态观察和生理生化特征分析，确定菌株WYG5为巨大芽孢杆菌。

2.2菌株WYG5皿内拮抗活性的测定

采用十字交叉法测定菌株WYG5对芒果炭疽病菌的皿内拮抗活性，结果表明，该内生细菌对芒果炭疽病菌有明显的拮抗作用，能够有效抑制该病原菌菌丝在PDA培养基中的扩展，抑制率达到32%。

2.3菌株WYG5对芒果的防病效果

内生细菌WYG5的不同处理液对采后芒果的保鲜防病效果见表1。6 d相对于芒果保鲜来说时间较短，6 d时对照组病情指数仅为7.04，处理防效虽高但意义不大，故重点讨论了9 d和12 d的防效。其中菌株发酵液及发酵滤液处理9 d时的防效分别为60.76%和59.50%，不存在显著差异；12 d时的防效分别为43.59%和34.19%，存在极显著差异，发酵液的保鲜防病效果明显优于发酵滤液。稀释10倍发酵液处理9 d时的防效为54.43%，与发酵液处理不存在显著差异，而处理12 d时两处理防效差异极显著。稀释10倍发酵滤液处理9 d和12 d时的防效均极显著低于发酵滤液的防效。

3结论与讨论

巨大芽孢杆菌作为植物内生细菌已有报道，如农倩等[7]从水稻体内分离到一株巨大芽孢杆菌B196，对水稻纹枯病菌的生长具有较强的抑制作用，盆栽和田间防效分别为64.29%和55.13%；林天兴等[8]从苦豆子中分离出48株对棉花枯萎病菌和黄萎病菌有较强拮抗作用的内生细菌，并对其遗传多样性进行了分析，发现这些菌株分别属于Bacillus atrophaeus、Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Bacillus megaterium、Bacillus pumilus、Serratia marcescens；张鑫等[9]从无纹紫背苔叶片中分离出一株内生菌z12，鉴定为巨大芽孢杆菌，发现其对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌及水稻纹枯病菌均有较强的抑制作用；林娜等[10]从山苍子的根、茎、叶和果中分离出内生细菌52株，其中一株对辣椒疫霉病的防治效果较好，且可促进辣椒植株生长。试验从南酸枣中分离到一株对芒果炭疽病菌拮抗作用较强的菌株WYG5，通过形态观察、生理生化测定及16S rDNA序列分析，鉴定将该菌株为巨大芽孢杆菌，经测定该菌株发酵液及发酵滤液对采后芒果均有明显的保鲜防病效果，处理9 d后防效分别为 60.76%和 59.50%，12 d后的防效分别为43.59%和34.19%，有关该菌的抗病机理及抑菌活性物质还有待进一步研究。

参考文献：

[1] 熊冬生，浦跃武，吴晓英.南酸枣植物在药物方面的研究概况及其应用前景[J].广东药学，2000，10（5）：8-10.

[2] 江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海人民出版社，1977.

[3] 姜怡，杨颖，陈华红，等.植物内生菌资源[J].微生物学通报，2005，32（6）：146-147.

[4] 卢镇岳，杨新芳，冯永君.植物内生细菌的分离、分类、定殖与应用[J].生命科学，2006，18（1）： 90-94.

[5] 张颖，王刚，郭建伟，等.利用小麦内生细菌防治小麦全蚀病的初步研究[J].植物病理学报，2007，37（1）： 105-108.

[6] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京： 科学出版社，2001.

[7] 农倩，陈雪凤，黎起秦，等.水稻内生细菌B196的鉴定及其对水稻纹枯病的防治作用[J].中国生物防治学报，2011，27（1）：99-103.

[8] 林天兴，李超，龚明福.拮抗性苦豆子内生细菌的遗传多样性[J].安徽农业科学，2011，39（24）： 14673-14675.

[9] 张鑫，王婷，崔灵芝，等.苔藓内生菌Bacillus megaterium z12的分离、鉴定和抗菌活性筛选[J].中国抗生素杂志，2012，37（6）： 401-405，420.

[10] 林娜，游玲，郭华，等.山苍子内生细菌的分离及抑菌活性研究[J].安徽农业科学，2012，40（6）： 3382-3384，3564.

果实发病程度分级方法如下，0 级：无病；1 级：病斑面积占果实面积的5%以下；3 级：病斑面积占果实面积的 6%～15%；5 级：病斑面积占果实面积的 16%～25%；7 级：病斑面积占果实面积的 26%～50%；9 级：病斑面积占果实面积的 50%以上。试验数据采用DPS处理，进行差异显著性分析。

病情指数= [∑（各级病果数×相对级数）/（调查总果数×9）]×100

防效=[（对照区病情指数-处理区病情指数）/对照病情指数]×100%。

2结果与分析

2.1菌株WYG5的鉴定

菌株WYG5在培养基上菌落呈圆形，浅黄色，边缘整齐，表面有凸状隆起，干燥，不透明，革兰氏染色阳性，芽孢染色阳性，菌体杆状，周生鞭毛。菌株WYG5 的形态和生理生化特征与东秀珠等[6]描述的巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）特征相同。对菌株WYG5的16S rDNA序列进行PCR扩增，产物经纯化后测序，得到 1 515 bp的碱基序列。将16S rDNA 序列进行BLAST分析，发现它与多株巨大芽孢杆菌菌株的同源性均在99%以上。选取GenBank中的8株芽孢杆菌属的细菌与菌株WYG5一起，利用软件MEGA 5.0构建出基于16S rDNA序列的系统发育树（图1）。由图1可以看出，菌株WYG5与巨大芽孢杆菌的同源性最高，结合形态观察和生理生化特征分析，确定菌株WYG5为巨大芽孢杆菌。

2.2菌株WYG5皿内拮抗活性的测定

采用十字交叉法测定菌株WYG5对芒果炭疽病菌的皿内拮抗活性，结果表明，该内生细菌对芒果炭疽病菌有明显的拮抗作用，能够有效抑制该病原菌菌丝在PDA培养基中的扩展，抑制率达到32%。

2.3菌株WYG5对芒果的防病效果

内生细菌WYG5的不同处理液对采后芒果的保鲜防病效果见表1。6 d相对于芒果保鲜来说时间较短，6 d时对照组病情指数仅为7.04，处理防效虽高但意义不大，故重点讨论了9 d和12 d的防效。其中菌株发酵液及发酵滤液处理9 d时的防效分别为60.76%和59.50%，不存在显著差异；12 d时的防效分别为43.59%和34.19%，存在极显著差异，发酵液的保鲜防病效果明显优于发酵滤液。稀释10倍发酵液处理9 d时的防效为54.43%，与发酵液处理不存在显著差异，而处理12 d时两处理防效差异极显著。稀释10倍发酵滤液处理9 d和12 d时的防效均极显著低于发酵滤液的防效。

3结论与讨论

巨大芽孢杆菌作为植物内生细菌已有报道，如农倩等[7]从水稻体内分离到一株巨大芽孢杆菌B196，对水稻纹枯病菌的生长具有较强的抑制作用，盆栽和田间防效分别为64.29%和55.13%；林天兴等[8]从苦豆子中分离出48株对棉花枯萎病菌和黄萎病菌有较强拮抗作用的内生细菌，并对其遗传多样性进行了分析，发现这些菌株分别属于Bacillus atrophaeus、Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Bacillus megaterium、Bacillus pumilus、Serratia marcescens；张鑫等[9]从无纹紫背苔叶片中分离出一株内生菌z12，鉴定为巨大芽孢杆菌，发现其对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌及水稻纹枯病菌均有较强的抑制作用；林娜等[10]从山苍子的根、茎、叶和果中分离出内生细菌52株，其中一株对辣椒疫霉病的防治效果较好，且可促进辣椒植株生长。试验从南酸枣中分离到一株对芒果炭疽病菌拮抗作用较强的菌株WYG5，通过形态观察、生理生化测定及16S rDNA序列分析，鉴定将该菌株为巨大芽孢杆菌，经测定该菌株发酵液及发酵滤液对采后芒果均有明显的保鲜防病效果，处理9 d后防效分别为 60.76%和 59.50%，12 d后的防效分别为43.59%和34.19%，有关该菌的抗病机理及抑菌活性物质还有待进一步研究。

参考文献：

[1] 熊冬生，浦跃武，吴晓英.南酸枣植物在药物方面的研究概况及其应用前景[J].广东药学，2000，10（5）：8-10.

[2] 江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海人民出版社，1977.

[3] 姜怡，杨颖，陈华红，等.植物内生菌资源[J].微生物学通报，2005，32（6）：146-147.

[4] 卢镇岳，杨新芳，冯永君.植物内生细菌的分离、分类、定殖与应用[J].生命科学，2006，18（1）： 90-94.

[5] 张颖，王刚，郭建伟，等.利用小麦内生细菌防治小麦全蚀病的初步研究[J].植物病理学报，2007，37（1）： 105-108.

[6] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京： 科学出版社，2001.

[7] 农倩，陈雪凤，黎起秦，等.水稻内生细菌B196的鉴定及其对水稻纹枯病的防治作用[J].中国生物防治学报，2011，27（1）：99-103.

[8] 林天兴，李超，龚明福.拮抗性苦豆子内生细菌的遗传多样性[J].安徽农业科学，2011，39（24）： 14673-14675.

[9] 张鑫，王婷，崔灵芝，等.苔藓内生菌Bacillus megaterium z12的分离、鉴定和抗菌活性筛选[J].中国抗生素杂志，2012，37（6）： 401-405，420.

[10] 林娜，游玲，郭华，等.山苍子内生细菌的分离及抑菌活性研究[J].安徽农业科学，2012，40（6）： 3382-3384，3564.

果实发病程度分级方法如下，0 级：无病；1 级：病斑面积占果实面积的5%以下；3 级：病斑面积占果实面积的 6%～15%；5 级：病斑面积占果实面积的 16%～25%；7 级：病斑面积占果实面积的 26%～50%；9 级：病斑面积占果实面积的 50%以上。试验数据采用DPS处理，进行差异显著性分析。

病情指数= [∑（各级病果数×相对级数）/（调查总果数×9）]×100

防效=[（对照区病情指数-处理区病情指数）/对照病情指数]×100%。

2结果与分析

2.1菌株WYG5的鉴定

菌株WYG5在培养基上菌落呈圆形，浅黄色，边缘整齐，表面有凸状隆起，干燥，不透明，革兰氏染色阳性，芽孢染色阳性，菌体杆状，周生鞭毛。菌株WYG5 的形态和生理生化特征与东秀珠等[6]描述的巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）特征相同。对菌株WYG5的16S rDNA序列进行PCR扩增，产物经纯化后测序，得到 1 515 bp的碱基序列。将16S rDNA 序列进行BLAST分析，发现它与多株巨大芽孢杆菌菌株的同源性均在99%以上。选取GenBank中的8株芽孢杆菌属的细菌与菌株WYG5一起，利用软件MEGA 5.0构建出基于16S rDNA序列的系统发育树（图1）。由图1可以看出，菌株WYG5与巨大芽孢杆菌的同源性最高，结合形态观察和生理生化特征分析，确定菌株WYG5为巨大芽孢杆菌。

2.2菌株WYG5皿内拮抗活性的测定

采用十字交叉法测定菌株WYG5对芒果炭疽病菌的皿内拮抗活性，结果表明，该内生细菌对芒果炭疽病菌有明显的拮抗作用，能够有效抑制该病原菌菌丝在PDA培养基中的扩展，抑制率达到32%。

2.3菌株WYG5对芒果的防病效果

内生细菌WYG5的不同处理液对采后芒果的保鲜防病效果见表1。6 d相对于芒果保鲜来说时间较短，6 d时对照组病情指数仅为7.04，处理防效虽高但意义不大，故重点讨论了9 d和12 d的防效。其中菌株发酵液及发酵滤液处理9 d时的防效分别为60.76%和59.50%，不存在显著差异；12 d时的防效分别为43.59%和34.19%，存在极显著差异，发酵液的保鲜防病效果明显优于发酵滤液。稀释10倍发酵液处理9 d时的防效为54.43%，与发酵液处理不存在显著差异，而处理12 d时两处理防效差异极显著。稀释10倍发酵滤液处理9 d和12 d时的防效均极显著低于发酵滤液的防效。

3结论与讨论

巨大芽孢杆菌作为植物内生细菌已有报道，如农倩等[7]从水稻体内分离到一株巨大芽孢杆菌B196，对水稻纹枯病菌的生长具有较强的抑制作用，盆栽和田间防效分别为64.29%和55.13%；林天兴等[8]从苦豆子中分离出48株对棉花枯萎病菌和黄萎病菌有较强拮抗作用的内生细菌，并对其遗传多样性进行了分析，发现这些菌株分别属于Bacillus atrophaeus、Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Bacillus megaterium、Bacillus pumilus、Serratia marcescens；张鑫等[9]从无纹紫背苔叶片中分离出一株内生菌z12，鉴定为巨大芽孢杆菌，发现其对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌及水稻纹枯病菌均有较强的抑制作用；林娜等[10]从山苍子的根、茎、叶和果中分离出内生细菌52株，其中一株对辣椒疫霉病的防治效果较好，且可促进辣椒植株生长。试验从南酸枣中分离到一株对芒果炭疽病菌拮抗作用较强的菌株WYG5，通过形态观察、生理生化测定及16S rDNA序列分析，鉴定将该菌株为巨大芽孢杆菌，经测定该菌株发酵液及发酵滤液对采后芒果均有明显的保鲜防病效果，处理9 d后防效分别为 60.76%和 59.50%，12 d后的防效分别为43.59%和34.19%，有关该菌的抗病机理及抑菌活性物质还有待进一步研究。

参考文献：

[1] 熊冬生，浦跃武，吴晓英.南酸枣植物在药物方面的研究概况及其应用前景[J].广东药学，2000，10（5）：8-10.

[2] 江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海人民出版社，1977.

[3] 姜怡，杨颖，陈华红，等.植物内生菌资源[J].微生物学通报，2005，32（6）：146-147.

[4] 卢镇岳，杨新芳，冯永君.植物内生细菌的分离、分类、定殖与应用[J].生命科学，2006，18（1）： 90-94.

[5] 张颖，王刚，郭建伟，等.利用小麦内生细菌防治小麦全蚀病的初步研究[J].植物病理学报，2007，37（1）： 105-108.

[6] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京： 科学出版社，2001.

[7] 农倩，陈雪凤，黎起秦，等.水稻内生细菌B196的鉴定及其对水稻纹枯病的防治作用[J].中国生物防治学报，2011，27（1）：99-103.

[8] 林天兴，李超，龚明福.拮抗性苦豆子内生细菌的遗传多样性[J].安徽农业科学，2011，39（24）： 14673-14675.

[9] 张鑫，王婷，崔灵芝，等.苔藓内生菌Bacillus megaterium z12的分离、鉴定和抗菌活性筛选[J].中国抗生素杂志，2012，37（6）： 401-405，420.

[10] 林娜，游玲，郭华，等.山苍子内生细菌的分离及抑菌活性研究[J].安徽农业科学，2012，40（6）： 3382-3384，3564.