郭月宁，王立国，王夏珍，张 薇

肝肺综合征（hepatopulmonary syndrome，HPS）是指肺血管扩张、低氧血症和一系列病理生理学变化及临床表现。肝硬化患者最终发生肝肺综合征的几率高达29%，两年半的病死率可达41%[1]。这使得找到肝肺综合征的发病机制显得尤为重要。但是国内外关于HPS的发病机制尚不完全明确。有研究表明，肺血管扩张是HPS最主要的病理基础[2]。肺血管扩张并形成分流，从而引起低氧血症，进而形成HPS是国内外比较一致的观点。肺血管扩张是如何形成的成为了研究

的热点。相关文献显示，在肝脏发生病变时，肝脏降解内毒素的功能降低，形成肠源性内毒素血症[3]。肺脏代偿性成为解毒的主要场所，内毒素刺激肺部形成肺血管巨噬细胞，肺血管巨噬细胞促进血管扩张因子的形成，引起肺部血管的扩张，进而形成肝肺综合征。所以，有人认为内毒素血症及肺血管巨噬细胞是促进肺血管扩张的主要根源。国内、外相关文献显示，采用胆总管结扎法（common bile duct ligation，CBDL）制造大鼠肝肺综合征模型是目前较成熟的方法[4]。本实验采用CBDL法制备肝肺综合征模型，研究动物血内毒素水平的变化，并观察了大鼠肺内是否出现了肺血管巨噬细胞，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 购自青岛派特福德白鼠养殖专业合作社的Wistar大鼠30只,体质量约200～250 g。

1.2 建立肝肺综合征模型 将大鼠在条件适宜的动物实验室内饲养。随机将动物分为三组，即假手术组（n=10）和手术组（即胆总管结扎组，CBDL组），再将CBDL组分为 CBDL 2周组（2 wk，n=10）、CBDL 5周组（5 wk，n=10）。给予4%水合氯醛1 ml.100g-1腹腔注射麻醉。假手术组大鼠沿腹白线打开腹腔后，分离胆总管，不结扎即关腹；CBDL组用4号丝线分别在近肝门处和近十二指肠端双线结扎胆总管后关腹。在造模后2 w及5 w时处死动物，取出肝组织和肺组织，取大块肝、肺组织放入10%中性甲醛中固定，制成蜡块、切片，用于HE染色。

1.3 血气分析测定 自左心室取血3～4 ml，应用血气分析仪（美国RADISMETER公司生产的ABL700型）测定PaO2和PaCO2，以此判断肝肺综合征的形成。

1.4 血浆中相关指标检测 采用凝集反应法（鲎试剂）检测血浆内毒素（湛江博康海洋生物有限公司）；采用硝酸还原酶法测定血清NO（上海研卉生物科技有限公司）；采用ELISA法检测TNF-α（上海研吉生物科技有限公司）。

1.5 腹部超声检查 使用加拿大超声医疗技术有限公司生产的Sonix OP超声诊断仪检查胆总管扩张程度。

2 结果

2.1 血气分析情况 在CBDL 5 wk组，动物血PaO2明显低于假手术组（P<0.05），符合HPS特征性动脉血气变化（表1）。

表1 各组血气分析结果（±s）

表1 各组血气分析结果（±s）

与假手术组比，①P<0.05

?

2.2 血浆内毒素、NO和TNF-α水平的变化 CBDL 5 wk组动物血浆内毒素、NO水平和TNF-α水平明显高于假手术组（P<0.05，表2）。

表2 血浆内毒素、NO和TNF-α水平（±s）的变化

表2 血浆内毒素、NO和TNF-α水平（±s）的变化

与假手术组比，①P<0.05

?

2.3 胆总管扩张情况 CBDL 5 wk动物胆总管比假手术组或CBDL 2 wk组明显扩张（图1），而CBDL 2 wk组与假手术组比，变化不明显（图2）。

图1 腹部超声表现 CBDL 5 wk组大鼠胆总管明显扩张

图2 腹部超声表现 假手术组动物胆总管无明显扩张

2.4 肝、肺组织病理学变化 大体观察可见CBDL 2 wk大鼠肝脏变大，淡黄色，边缘不锐利；在胆总管结扎后5 wk，大鼠肝脏肿大，颜色加深，表面存在黄色小结节。在显微镜下观察，CBDL 2 wk动物肝脏汇管区小胆管扩张，细胞呈灶状坏死，血管周围有大量炎细胞聚集（图3）；CBDL 5 wk组动物上述变化更加明显，周围结缔组织出现增生并且分隔，肝细胞排列紊乱，细胞融合，细胞核固缩，部分肝细胞融解消失，形成空泡（图4）。CBDL 5 wk组肺组织可见广泛充血，炎性细胞浸润，毛细血管扩张（图5），且出现肺血管巨噬细胞（图6）。假手术组肝肺组织无明显变化。

图3 肝组织病理学变化 在胆总管结扎2 wk后，肝脏炎症细胞聚集、浸润（HE，400×）

图4 肝组织病理学变化 CBDL 5 wk组动物肝细胞排列紊乱，细胞融合，细胞核固缩，结缔组织增生（HE，400×）

图5 肺组织病理学表现 CBDL 5 wk组动物肺组织可见广泛充血，炎性细胞浸润，毛细血管扩张（HE，400×）

图6 肺组织病理学表现 CBDL 5 wk组动物肺血管内出现巨噬细胞（HE，100×）

3 讨论

HPS是在慢性肝病及门静脉高压的基础上出现的动脉血氧合功能异常、肺血管扩张等一系列表现，在临床上主要以进行性呼吸困难、低氧血症为主要表现[1]。多数研究表明肝肺综合征的本质是肝病时发生了肺血管扩张及肺动脉氧合功能降低，而引起低氧血症[5]。

关于HPS的发病机制尚不完全明确，而肺血管扩张是引起肺通气/灌注不匹配，出现低氧血症的主要原因[6]，这一点在国内外均较为认同。肺血管扩张在肝肺综合征形成中起到关键性作用。肺血管扩张机制较为复杂。大量实验研究表明，可能是由于肺血管内的缩血管活性因子与扩血管活性因子之间的失衡所导致的[7]。关于肺血管内扩张活性因子，如NO等的生成，有相关研究显示是由于肝脏功能下降，消除内毒素水平降低，使得内毒素入血，进而诱导肺血管内形成巨噬细胞，肺血管巨噬细胞吞噬了血液中的异物后分泌所生成的[8]。

本实验旨在研究内毒素及肺血管内巨噬细胞在肺血管扩张中的作用，从而更进一步研究肝肺综合征的发生机制，为临床诊治提供更好的依据。

内毒素是导致感染性休克的最重要的生物因子。主要的作用靶细胞之一为内皮细胞，最易受到攻击的靶器官是肺和肠[9]。内毒素本身可导致细胞自溶，由此形成肠源性内毒素血症和肠粘膜通透性之间的恶性循环。内毒素的作用越来越受到重视[10]。最近研究证明，肝硬化大鼠细菌异位与HPS密切相关，在HPS发生时存在菌血症和肠源性内毒素血症，内毒素能诱导机体产生肺血管巨噬细胞，促进炎性细胞在肺血管内皮细胞粘附聚集，引起肺炎症反应。本实验在胆总管结扎2 wk和5 wk观察，动物血内毒素水平随着时间的延长而逐步升高，充分说明其在肝肺综合征形成过程中的重要作用。

在正常大鼠肺内是没有巨噬细胞的[11]。已有研究证明，在内毒素诱导肺急性损伤时可导致肺泡毛细血管通透性增加，促进巨噬细胞在肺内聚集，导致大量炎症因子释放。研究发现HPS大鼠肺内聚集大量的巨噬细胞。肺血管巨噬细胞吞噬功能增强,清除血液中的肠道菌群和内毒素,同时分泌大量的血管活性物质,包括 NO、TNF-α[12]、ET-1等，引起肺血管扩张[13]。相关研究证实，应用抑制TNF-α的制剂可以抑制肠道细菌易位，减少肠道细菌的过度生长，有效地预防HPS的发生[14]。本研究显示，在肝肺综合征形成过程中NO、TNF-α水平明显升高，说明内毒素刺激肺血管巨噬细胞形成并分泌了扩血管活性因子，促进肺血管扩张，进而形成了肝肺综合征。

CBDL大鼠可较好地复制HPS模型，并被广泛应用于实验研究[15]。本实验创新点之一为在结扎胆总管时，并不对胆总管进行剪断，减少了胆总管内胆汁对腹腔的刺激。在本研究中，动物在结扎胆总管后，随着时间的延长，发现大鼠肝脏逐渐变大，颜色由淡黄到灰黄色，质地逐渐变硬，直至肝表面出现黄色小结节；在显微镜下观察肝脏汇管区小胆管扩张，肝细胞灶状坏死。动物血PaCO2、PaO2出现相应的病理生理学改变，NO等明显升高，证明CBDL模型建立成功。本实验的另一创新点为动脉血的采集。大鼠的腹主动脉在进针后易破裂，血流出后使腹腔视野变得模糊，影响肝组织的留取。经左心室取血，手术较容易，且不易破裂，采血量能够达到血气分析的要求。

本实验中增加了对大鼠肝脏及结扎胆总管进行彩色多普勒超声检查，以便于密切关注造模情况，对于观察模型的建造成功起到了监测作用。

肺血管扩张是HPS发病机制中出现低氧血症的主要原因。本实验中CBDL组在肝脏发生病理变化的同时，肺组织出现毛细血管扩张，说明肺内毛细血管扩张与肝肺综合征的形成有关。检测动脉血PaO2进行性下降，证明肺血管扩张是导致低氧血症的原因。

本实验证明，在肝肺综合征形成过程中，内毒素起到关键性的重要作用，它可以刺激大鼠体内肺血管巨噬细胞的生成，进而由肺血管巨噬细胞分泌扩血管活性因子如NO等，使得肺血管出现扩张，形成低氧血症，进而形成肝肺综合征。但关于肺血管巨噬细胞是通过哪些信号传导途径引起扩血管活性因子分泌的，到现在仍不是很清楚，下一步实验将进一步探讨。

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