刘长江，徐晓荣，冯国营

（1.山东省莱芜市人民医院 呼吸内科，山东 莱芜 271100；2.滨州医学院 神经生物学研究所，山东 滨州 256603）

重组人血管内皮抑制素靶向治疗非小细胞肺癌的分子生物学研究

刘长江1，徐晓荣1，冯国营2

（1.山东省莱芜市人民医院 呼吸内科，山东 莱芜 271100；2.滨州医学院 神经生物学研究所，山东 滨州 256603）

目的探讨分子生学标记物与重组人血管内皮抑制素靶向治疗非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）疗效之间的关系。方法选择符合要求的非小细胞肺癌患者68例，随机均分为A组和B组，每组34例。A组采用多西他赛＋顺铂（docetaxel and cisplatin，DP）及吉非替尼化疗，B组在A组化疗方案的基础上加用重组人血管内皮抑制素。采用免疫组化的方法检测表皮生长因子受体（epidermao growth factor receptor，EGFR）、KRAS基因（K-ras，p21）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）、乳腺癌1号基因（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）、棘皮动物微管相关类蛋白4与间变性淋巴瘤激酶融合基因（echinoderm microtubule-associated protein-like-4-anaplastic lymphoma kinase，EML4-ALK）、核苷酸切除修复交叉互补1（excision repair cross complementing 1，ERCC1）、β-微管蛋白和分化抗原簇3（Cluster of differentiation 3，CD3）生物学标记物的表达情况。结合2组患者生物学标志物的表达情况和无进展生存期（progression free survival，PFS），统计出适合不同方案的人群类型。结果B组的中位PFS较A组显著延长；无论VEGF和BRCA1低表达或高表达，B组的中位PFS较A组显著提高；ERCC1、KRAS、EML4-ALK和β-微管蛋白高表达，B组的中位PFS较A组有显著提高；EGFR和CD3低表达，B组的中位PFS较A组显著延长（P＜0.05）。结论VEGF和BRCA1高表达或低表达，KRAS、ERCC1、EML4-ALK和β-微管蛋白高表达及EGFR和CD3低表达的非小细胞肺癌患者对DP及吉非替尼联合重组人血管内皮抑制素靶向治疗较为敏感。

非小细胞肺癌；重组人血管内皮抑制素；分子生物学

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2010年1月～2013年12月山东省莱芜市人民医院收治的肺癌根治术治疗的非小细胞肺癌患者68例，年龄45岁～70岁，平均（55.3±0.9）岁，术后随机分为2组，A组34例，男22例，女12例，给予多西他赛＋顺铂（docetaxel and cisplatin，DP）及吉非替尼化疗；B组34例，男24例，女 10例，B组在A组化疗方案的基础上加用重组人血管内皮抑制素，并将每例患者切除的组织制作成符合切片标准的病理蜡块。2组患者年龄、性别、肿瘤级别分布、功能状态（performance status，PS）评分和高血压、糖尿病等慢性病史差异无统计学意义，具有可比性。排除术前接受过DP化疗，有其他系统严重疾病和神经精神异常的患者。本实验得到伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 研究方法 68例患者术后辅助化疗方案均采用常规DP化疗4个周期：第1 d静脉滴注多西他赛（杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司，国药准字J20090104）75mg／m2，第1天至第3天静脉滴注顺铂（江苏豪森药业股份有限公司，国药准字H20040813）25mg／m2，每个周期持续 21 d，每天给予吉非替尼（AstraZeneca UK Limited，国药准字 J20100014）250mg口服；B组患者在A组的基础上每个周期的前14 d，每天静脉滴注重组人血管内皮抑制素（山东先声麦得津生物制药有限公司，国药准字S20050088）15mg，期间常规给予水化、利尿、止吐、镇痛、营养等支持治疗，如果并发大量胸水，采用间断抽吸减压，如果出现无法耐受的毒副反应则停药。

1.3 实验方法 将符合研究条件的病理蜡块切片，采用免疫组化法检测表皮生长因子受体（epidermao growth factor receptor，EGFR）［8］、KRAS基因（K-ras，p21）［9］、血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）［10］、乳腺癌 1号基因（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）［11］、棘皮动物微管相关类蛋白4与间变性淋巴瘤激酶融合基因（echinoderm microtubule-associated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase，EML4-ALK）［12］、核苷酸切除修复交叉互补1（excision repair cross complementing 1，ERCC1）［13］、β-微管蛋白［14］、分化抗原簇 315］（Cluster of differentiation 3，CD3）的表达情况。每批染色以磷酸盐缓冲液代替一抗设定阴性空白对照，同时用已知阳性标本作为阳性对照，“－～＋”认定为低表达，“＋＋～＋＋＋”认定为高表达。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0软件分析，患者的中位无进展生存期（progression free survival，PFS）采用 Kaplan-Meier法分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组患者不同生物标志物表达分布情况 通过采用免疫组化分析2组患者癌症组织中不同生物标志物（见表1、图1）

表1 2组患者不同生物标志物高表达和低表达分布Tab.1 Different biomarkers distribution with high expression and low expression in two groups

2.2 2组患者中位无进展生存期比较 通过Kaplan-Meier法分析，结果显示B组的中位PFS较A组显著延长（P＜0.05，见图 2）。

图2 2组患者总的中位无进展生存期比较Fig.2 Compare the overallmedian progression free survival in two groups

2.3 生物标志物高表达与2组患者中位无进展生存期的相关性 KRAS、VEGF、BRCA1、EML4-ALK、ERCC1和 β-微管蛋白高表达时，B组中位PFS较A组显著延长（P＜0.05）。EGFR高表达时，2组中位PFS未见明显差异（见图3～图9）。

图3 KRAS高表达时2组患者总的中位无进展生存期比较Fig.3 Compare the overallmedian progression free survival in two groups while KRASwith high expression

图4 VEGF高表达时2组患者总的中位生存期比较Fig.4 Compare the overallmedian progression free survival in two groupswhile VEGFwith high expression

图5 BRCA1高表达时2组患者总的中位生存期比较Fig.5 Compare the overallmedian progression free survival in two groups while BRCA1 with high expression

图6 EML4-ALK高表达时两组患者总的中位生存期比较Fig.6 Compare the overallmedian progression free survival in two groupswhile EML4-ALK with high expression

图7 ERCC1高表达时2组患者总的中位生存期比较Fig.7 Compare the overallmedian progression free survival in two groupswhile ERCC1 with high expression

图8 β微管蛋白高表达时2组患者总的中位生存期比较Fig.8 Compare the overallmedian progression free survival in two groups whileβ-tubulin with high expression

图9 EGFR高表达时2组患者总的中位生存期比较Fig.9 Compare the overallmedian progression free survival in two groups while EGFR with high expression

2.4 低表达水平的生物标志物与2组患者中位生存期的相关性 EGFR、CD3、VEGF、KRAS和 BRCA1低表达时，B组中位PFS较A组显著延长（P＜0.05）。EML4-ALK、ERCC1和β-微管蛋白低表达时，2组中位PFS未见明显差异（见图10～图14）。

图10 EGFR低表达时2组患者总的中位生存期比较Fig.10 Compare the overallmedian progression free survival in two groups while EGFR with low expression

图11 CD3低表达时2组患者总的中位生存期比较Fig.11 Compare the overallmedian progression free survival in two groups while CD3 with low expression

图12 VEGF低表达时2组患者总的中位生存期比较Fig.12 Compare the overallmedian progression free survival in two groups while VEGF with low expression

图13 KRAS低表达时2组患者总的中位生存期比较Fig.13 Compare the overallmedian progression free survival in two groupswhile KRASwith low expression

图14 BRCA1低表达时2组患者总的中位生存期比较Fig.14 Compare the overallmedian progression free survival in two groupswhile BRCA1 with low expression

图15 EML4-ALK低表达时2组患者总的中位生存期比较Fig.15 Compare the overallmedian progression free survival in two groups while EML4-ALK with low expression

图16 ERCC1低表达时2组患者总的中位生存期比较Fig.16 Compare the overallmedian progression free survival in two groups while ERCC1 with low expression

图17 β-微管蛋白低表达时2组患者总的中位生存期比较Fig.17 Compare the overallmedian progression free survival in two groups whileβ-tubulin with low expression

3 讨论

本研究发现，DP及吉非替尼联用重组人血管内皮抑制素用于NSCLC的术后辅助治疗效果优于DP及吉非替尼，DP及吉非替尼联合重组人血管内皮抑制素组的中位无进展生存期较DP及吉非替尼组明显延长（P＜0.05）。无论 VEGF、KRSA和BRCA1高表达或低表达，DP及吉非替尼联合重组人血管内皮抑制素组的中位PFS较DP及吉非替尼组均显著提高（P＜0.05）。ERCC1、β-微管蛋白和EML4-ALK高表达，DP及吉非替尼联合重组人血管内皮抑制素组的中位PFS较DP及吉非替尼组有显著提高（P＜0.05）；CD3和EGFR低表达，DP及吉非替尼联合重组人血管内皮抑制素组的中位PFS较DP及吉非替尼组显著延长（P＜0.05）。EGFR高表达，DP及吉非替尼联合重组人血管内皮抑制素组的中位PFS较DP及吉非替尼组无显著差异；EML4-ALK、ERCC1和β-微管蛋白低表达，DP及吉非替尼联合重组人血管内皮抑制素组的中位PFS较DP及吉非替尼组无显著差异。此结果提示，抗癌药物的联合应用在非小细胞肺癌化疗后的治疗具有明显优势，但是在研究中也有部分患者不能耐受2种药物的联合应用。此外联合应用药物组对于血管新生因子方面的抑制作用也优于单一药物治疗。本研究结果提示，无论VEGF和 BRCA1高表达或低表达；KRAS、ERCC1、EML4-ALK和β-微管蛋白高表达及EGFR和CD3低表达的NSCLC患者可能对DP及吉非替尼联合重组人血管内皮抑制素靶向治疗方案较为敏感。

由于肺癌其死亡率高，在我国其发生率和死亡率达到80%以上，是目前国内外临床医师关注的焦点。该病大多为非小细胞肺癌［8-11］。由于外科手术切除病灶是治疗NSCLC最有效的方法，但其术后生存率和晚期患者的生存质量并不乐观，因此肿瘤治疗耐药机制以及治疗效果预测一直是肿瘤学专家最为关注的问题［12］。肿瘤分子靶向治疗不仅可以阻滞肿瘤细胞的增殖、消灭肿瘤细胞，而且可以降低化疗药物的毒副作用。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂——吉非替尼目前治疗NSCLC效果较为明显［13-15］，但症状改善1年左右多数患者容易出现耐受现象，而针对耐受现象的后续治疗目前没有统一的治疗标准［16］。研究发现联合治疗可能会解决单一用药的耐药或抗药性，减少组织细胞间的异质性，对治疗的反应和敏感度有一定的改善效果［17］。重组人血管内皮抑制素［18］主要从血管的形成和退缩方面抑制肿瘤的发生发展，本研究通过化疗敏感性相关基因、肿瘤血管形成相关基因和细胞免疫相关基因的研究，检测EGFR、VEGF等不同生物学标志物的表达情况，结合不同治疗方案的结局，避免了单个分子生物学标志物预测术后化疗联合辅助分子靶向治疗评估疗效的局限性，为综合治疗方法提供理论基础，奠定生物学基础，并可在接受术后辅助治疗前，做好个体化评估和区分，为患者选择更准确、更合理的个性化治疗方案，也在一定程度上避免了过度治疗。

本研究病例数较少，在今后的研究中，需要更多的学者和多中心共同合作，扩大样本量，对更多的分子生物学指标物进行检测研究，探索与NSCLC术后患者PFS的关系，努力寻求靶向治疗药物的特异性分子生物学指标，建立有效的、个性化的治疗疗效预测模型，为患者提供个体化的综合治疗，从而改善患者的术后生活质量，提高术后生存期。

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（编校：李璐璐）

M olecular biology research of recombinant human endostatin targeted therapy of non-small-cell lung cancer

LIU Chang-jiang1，XU Xiao-rong1，FENG Guo-ying2

（1.Department of Respiratory Medicine，Laiwu City People's Hospital，Laiwu 271100，China；2.Institute of Nearobiology，Binzhou Medical College，Binzhou 256603，China）

ObjectiveTo investigate the relationship between molecular biologicalmarkers and recombinant human endostatin targeted therapy in non-small-cell lung cancer（NSCLC）.Methods68 cases patients with non-small-cell lung cancer to meet the requirements were random ly divided into group A（n＝34）and group B（n＝34）.Group A received docetaxel and cisplatin（DP）and gefitinib；group B received recombinant human endostatin on the base of group A.The biologicalmarkers species，such as，EGFR，KRAS，VEGF，BRCA1，EML4-ALK，ERCC1，β-tubulin and CD3 were detected by immunohistochemical.The types of population for differentprogramswere summarized according to the expression of biologicalmarkers and progression free survival（PFS）of the two groups.ResultsGroup B median PFSwas significantly longer than that in group A；no matter low or high expression of VEGF and BRCA1，group Bmedian PFSwas significantly longer than that in group A（P＜0.05）；high expression of ERCC1，KRAS，EML4-ALK and β-tubulin，group B median PFSwas significantly longer than that in group A（P＜0.05）；low expression of EGFR and CD3，group Bmedian PFSwas significantly longer than that in group A（P＜0.05）.ConclusionNo matter low or high expression of VEGF and BRCA1，low expression of KRAS，ERCC1，EML4-ALK andβ-tubulin and high expression of EGFR and CD3 in patients with non-small cell lung cancermay be more sensitive to the treatment of DP and gefitinib combined with recombinant human endostatin.

non-small cell lung cancer；recombinant human endostatin；molecular biology

R734.2

A

1005－1678（2014）04－0100－06

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌中最常见的一种类型，和其他类型肺癌一样，治疗以手术切除病变组织为主，但即使完全切除，Ⅰ期患者的术后5年生存率也只有50%左右，Ⅱ期和Ⅲ期患者存活率甚至不到30%［1-3］。针对这一情况，手术患者必须结合术后辅助化疗。手术结合术后化疗的方法虽然取得一定成效，但同时一部分化疗药物出现不良反应，且存在较高的复发率和死亡率。肿瘤分子靶向治疗是随分子生物学的发展越来越受关注和推崇的一种新型个体化辅助治疗，是目前肿瘤治疗研究中的热点，不同的基因表达对治疗方案的敏感性不同，不同的靶向制剂具有不同的作用机制，适合不同类型的患者［4］。其中，吉非替尼［5］和重组人血管内皮抑制素［6］是目前临床上应用较为广泛的分子靶向药物中的2种。然而越来越多的报道指出，随着吉非替尼在临床上的普遍应用，耐药率逐年增加，给临床治疗NSCLC带来困难［7］。因此，本研究为探索适合术后辅助化疗及吉非替尼联合重组人血管内皮抑制素靶向治疗的最佳适应症人群，旨在提高这类患者的生存率，并降低其复发率。

山东省高校科技计划（J11LF61）

刘长江，男，硕士，主治医师，研究方向：呼吸内科学，E-mail：liuchangjiangsd＠163.com。