玄菲，徐芳

（1.山东省莱芜市人民医院 肿瘤科，山东 莱芜 271100；2.滨州医学院 基础医学院，山东 滨州 256603）

茶多酚联合莱菔硫烷对肺癌组织蛋白激酶A锚定蛋白95和细胞周期蛋白E2表达的影响

玄菲1，徐芳2

（1.山东省莱芜市人民医院 肿瘤科，山东 莱芜 271100；2.滨州医学院 基础医学院，山东 滨州 256603）

目的探讨茶多酚联合莱菔硫烷对肺癌组织中蛋白激酶A锚定蛋白95和细胞周期蛋白E2表达的影响。方法选取经病理证实并手术治疗的肺癌患者56例，随机分为联合给药组和对照组，每组28例。采用ELISA测定所有患者肺组织中蛋白激酶A锚定蛋白95及细胞周期蛋白E2的含量；免疫组化SP法测定组织中蛋白激酶A锚定蛋白95及细胞周期蛋白E2的表达并统计微血管密度（microvascular density，MVD）；Western Blot检测组织中蛋白激酶A锚定蛋白95及细胞周期蛋白E2蛋白表达情况。结果

对照组肺癌患者组织中蛋白激酶A锚定蛋白95及细胞周期蛋白E2的含量均高于联合给药组，差异有统计学意义（P＜0.01）；免疫組化SP法结果显示肺癌患者癌变组织中蛋白激酶A锚定蛋白95及细胞周期蛋白E2的表达均呈阳性表达，且对照组织中MVD高于联合给药组（P＜0.01）；Western Blot结果显示对照组组织中蛋白激酶A锚定蛋白95及细胞周期蛋白E2蛋白表达高于联合给药组（P＜0.01）。结论蛋白激酶A锚定蛋白95及细胞周期蛋白E2在肺癌患者组织中均存在表达升高现象，2者表达呈正相关，与药物治疗呈负相关，可以作为肺癌的评估检测指标。

蛋白激酶A锚定蛋白95；细胞周期蛋白E2；肺癌

茶多酚（tea polyphenols，TP）是茶叶中的有效成分，现有的文献资料报道茶多酚对肝癌、艾氏腹水癌等肿瘤都具有抗肿瘤效果［3-4］。茶多酚对肿瘤的治疗体现在每个阶段：诱导细胞凋亡、抑制肿瘤细胞的增殖、阻遏细胞传导通路、阻滞肿瘤细胞的细胞周期、抑制端粒酶活性、抑制血管形成等［5］。莱菔硫烷（sulforaphane，SFN）是十字花科植物中的成分，可以抑制化学物诱发肿瘤的起始阶段，对肿瘤有抑制作用［6］。近年的研究表明癌症的病变过程中，蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2起着相当重要的作用［7-9］。目前对于莱菔硫烷联合茶多酚治疗肺癌的研究报道较少，尤其是2者合用后对于肺癌组织中蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2的表达也鲜有研究。故本研究旨在探讨莱菔硫烷联合茶多酚对肺癌组织中蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2的影响，以期为临床用药提供一定的基础依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2010年11月～2013年8月山东省莱芜市人民医院肿瘤科收治的56例肺癌患者作为研究对象，均经病理证实且经过癌症组织切除手术的，随机分成对照组和给药组，每组28例。对照组患者平均年龄（67.2±7.9）岁，癌症分型：12例为管内型肺癌患者；结节型患者为3例；管壁浸润型患者为4例；块状型患者为7例；弥漫浸润性患者为2例。联合给药组平均年龄（68.1±7.4）岁，癌症分型：14例为管内型肺癌患者；结节型患者为4例；管壁浸润型患者为2例；块状型患者为5例；弥漫浸润性患者为3例。2组患者的年龄以及癌症分型经统计学分析无统计学差异，数据具有可比性。

1.2 治疗方法 联合给药组患者给予茶多酚（安徽省歙县茶叶生物碱厂，批准文号：皖卫食准号2009第137号），结合说明书，每天2次，每次2粒，连续服用2周期）和莱菔硫烷（上海谱振生物科技有限公司）联合治疗；对照组前期不用药物治疗，给予正常的护理。

1.3 检测指标

1.3.1 Western Blot检测2组患者蛋白激酶A锚定蛋白95受体（AKAP-8）和细胞周期蛋白E2受体的表达：取肺癌患者经手术切除后留下的鲜活肺部组织，液氮研磨使细胞破裂充分，将已经破碎的组织装入混匀器中进行混匀，按100μL／10ng加入含PMSF的裂解液，冰上孵育30min，低温12 000 r／min离心5min，取上清，－80℃冻存备用。总蛋白采用考马斯亮蓝进行定量。组织样品加入0.25倍量5×SDS上样缓冲液进行混匀，煮沸6min左右变性，用10%SDS-PAGE 115 V电泳，210mA恒流1 h 40min湿转至硝酸纤维膜上。用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭3 h，分别添加抗蛋白激酶A锚定蛋白95受体（AKAP-8）和细胞周期蛋白E2受体单抗（鼠抗人1∶500）。TBST洗膜3次，每次10min，结合辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）室温孵育1 h，TBS洗膜3次，每次10min，最后采用发光试剂盒ECL反应，X胶片曝光显影。

1.3.2 ELISA检测2组患者肺组织中蛋白激酶A锚定蛋白95和细胞周期蛋白E2含量：取患者新鲜肺癌组织，匀浆，低温3 000 r／min离心15min，取上清液置于－40℃保存待测。选用双抗体ELISA法测定蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2含量，试剂盒购于美国RnD公司，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。组织中蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2的表达采用吸光度值计算浓度（pg／mL）表示。

1.3.3 免疫组织化学检测2组患者肺组织微血管密度（MVD）：取患者肺癌变鲜活组织，浸泡在4%甲醛中固定，石蜡包埋，石蜡切片机切片。采用链霉菌抗生素蛋白过氧化物酶测定，实验步骤按照试剂盒说明书严格执行。用已知的蛋白激酶A锚定蛋白95和细胞周期蛋白E2肺癌组织做阳性对照，阴性对照组采用的是PBS作为一抗进行孵化，鼠抗人以及显色剂等均购自与北京中杉生物科技有限公司。

1.4 结果判定 根据参考文献统计MVD在肺癌组织中情况［10］：组织中蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2含量的测定采用的是灰度值扫描，通过与β-actin进行比较得出灰度值比。

1.5 统计学方法 分别采用SPSS 17.0和ImageJ 4.2对数据和图片进行处理。正态计量资料用“±s”表示，组间比较采用t检验。计数资料采用卡方检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组患者肺组织中蛋白激酶A锚定蛋白95和细胞周期蛋白E2含量比较 ELISA实验结果表明：给药组患者蛋白激酶A锚定蛋白95和细胞周期蛋白E2的含量均显著高于对照组患者，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

表1 2组患者肺组织蛋白激酶A锚定蛋白95和细胞周期蛋白E2含量比较（pg／mL）Tab.1 Comparision of protein kinase A anchoring protein 95 and cyclin E2 levels between two anchoring（pg／mL）

2.2 组织中蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2表达与血管关系 对照组肺癌患者病变组织中蛋白激酶A锚定蛋白95（67.0%）表达显著高于联合给药组（24.2%），2者差异有统计学意义（P＜0.01）；细胞周期蛋白E2（56.5%）也显著高于联合给药组（22.7%，P＜0.05）。在进行MVD计数中，对照组肺癌患者病变组织中以蛋白激酶A锚定蛋白95标记的MVD高于联合给药组（P＜0.01），对照组肺癌患者在病变组织中以细胞周期蛋白E2标记的MVD高于联合给药组织（P＜0.01，见图1、表 2）。

图1 免疫组化检测组织中蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2表达情况Fig.1 Expression of protein kinase A anchoring protein 95 and cyclin E2 in two groups by inmmunohistochemical detection

表2 各组组织中蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2表达与血管的关系的比较Tab.2 Comparision of the relationship between protein A kinase anchoring protein 95 and cyclin E2 expression and vascular in two groups

2.3 2组患者蛋白激酶A锚定蛋白95和细胞周期蛋白E2蛋白表达水平比较 Western Blot结果显示：给药组患者肺组织蛋白激酶A锚定蛋白95和细胞周期蛋白E2蛋白表达均显著少于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，见图2）。

图2 2组蛋白激酶A锚定蛋白95和细胞周期蛋白E2的蛋白表达比较*P＜0.05，**P＜0.01，与对照组比较Fig.2 Comparision of protein kinase A anchoring protein 95 and cyclin E2 protein expression in two groups*P＜0.05，**P＜0.01，compared with control group

3 讨论

本实验以蛋白激酶A锚定蛋白95和细胞周期蛋白E2为考察指标评价茶多酚联合莱菔硫烷对肺癌患者的治疗作用。目前的研究仅仅限于单一药物治疗肺癌。茶多酚在治疗恶性肿瘤方面的效果逐渐受到重视，而莱菔硫烷也被证实对于肺癌的治疗有一定的效果，目前2种药物联合使用用于肺癌手术后期治疗的研究很少。在本研究中，发现2种药物联合能下调肺癌组织蛋白激酶A锚定蛋白95和细胞周期蛋白E2蛋白的表达，差异有统计学意义（P＜0.05）。免疫组织化学结果显示联合给药组微血管密度（MVD）低于对照组，说明肿瘤组织生长受到了抑制，2种药物有抗肿瘤的效果。联合给药组的蛋白激酶A锚定蛋白95和细胞周期蛋白E2的表达均低于对照组，说明蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2的表达与肿瘤的生长呈正相关。

周期蛋白E2是细胞核内蛋白，位于8号染色体 q 22.1。mRNA大小为2.8 kb，由404个aa组成，相对分子质量是4.7×107KDa。周期蛋白E2和周期蛋白E1有47%的同源性，均拥有1个周期蛋白盒基序［11］。这个基序是所有的细胞周期蛋白所共同拥有的。AKAP 95一开始被认为是一种AKAP，它能够将PKA特异地锚定于细胞核内的作用［12］。最近发现AKAP95不仅仅是一种锚定蛋白，它还参与细胞内许多生命过程，如细胞分裂染色体集缩的建立以及集缩状态的维持［13］，DNA复制和维持mRNA的稳定、以及基因表达，参与细胞凋亡以及参与细胞周期调控［14-15］等。

本研究并没有考察茶多酚或者莱菔硫烷单独使用对于肺癌的治疗效果，主要是由于在前期的研究中发现单独使用其中1种药物，患者在癌症切除手术后生存时间以及对药物的敏感性并不是很高，处于以治疗为主，实验中未设置单独使用药物组。下一步的研究将跟踪随访药物治疗后患者的生存情况以及药物敏感性。蛋白激酶A锚定蛋白95和细胞周期蛋白E2的高表达在癌症患者诊断以及预后中是否具有参考价值，还需进一步研究。此外，是否可以通过检测患者血浆中相关蛋白从而更好对癌症以及预后进行评价，也是比较重要的问题。

综上所述，本研究茶多酚联合莱菔硫烷对于癌症患者组织中蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2具有明显的抑制作用，为预防和临床治疗癌症的发生提供了理论依据。

［1］ Langer CJ，Natale RB.The emerging role of vascular endothelial growth factor receptor tyro-sine kinase inhibitors［J］.Semin Oncol，2009，32（10）：23-29.

［2］ 李龙芸.探讨肺癌的早诊及个体化治疗［J］.中华肿瘤学杂志，2011，9（1）：5-6.

［3］ 阎玉森，王球达，邹玉珍，等.绿茶对荷瘤小鼠细胞免疫功能的影响及其抑瘤作用［J］.中华预防医学杂志，2013，26（1）：5-7.

［4］ Kadish AS，Doyle AT，Steinhauer EH，et al.Natural cytotoxic-ity and interferon production in human cancer：Deficient inatural killer activity and normal interferon production in patients with advanced disease［J］.J Immunol，2010，127（2）：1817-1822.

［5］ 廖系晗，金翠兰.茶多酚及其抗癌机理的研究进展［J］.时珍国医国药，2010，17（9）：1783-1785.

［6］ Faulkner K，Mithen R，Williamson G.Selective increase of the potential anticarcinogen 4-methylsulphinylbutyl glucosinolate in broccoli［J］.Carcinogenesis，2011，19（4）：605-609.

［7］ Ishii H，Mimori K，Yoshikawa Y，et al.Differential roles of E-type cyclins during transformation ofmurine E2F-1 deficient cells［J］.DNA Cell Biol，2011，24（3）：173-179.

［8］ Yamadai S，Sumrejkanchanakij P，Amagasa T，et al.Loss of cyclin E requiement in cell growth of an oral squamous cell carcinoma cell line implies deregulation of its downstream pathway［J］.Int JCancer，2009，111（1）：17-22.

［9］ Kim KI，Cho HJ，hahn JY，et al.Beta-catenin over expression augments angiogenesis and skeletalmuscle regeneration through dualmechanism of vascular endothelial growth factor-mediated endothelial cell proliferationand progenitor cell mobilization［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010，26（1）：91-98.

［10］ 刘东华.非小细胞肺癌VEGF-C的表达及LYVE-1标记的微血管密度与淋巴结转移的关系［J］.中国生化药物杂志，2012，32：3927-3928.

［11］ Zariwala M，Liu J，Xiong Y.Cyclin E2，a novel human G1 cyclin and activating partner of CDK2 and CDK3，is induced by viral oncoproteins［J］.Oncogene，2011，17（21）：2787-2798.

［12］ Coghlan VM，Langeberg LK，Fernandez A，et al.Cloning and characterization of AKAP 95，a nuclear protein that associateswith the regulatory subunitof type IIcAMP-dependent protein kinase［J］.JBiol Chem，2012，26（9）：7658-7660.

［13］ Turid E，Cathrine C，Kristin AT，etal.Distinctbutoverlapping domains of AKAP95 are implicated in chromosome condensation and condensin targeting［J］.JBiochem，2012，3（5）：426-432.

［14］ Tatjana A，Chantal D，Jacques E，et al.A novel partner for D-type cyclins：protein kinase A-anchoring protein AKAP95［J］.JBiochem，2013，37（8）：673-679.

［15］ Lorene KL，John DS.A-kinase-anchoring proteins［J］.2012，11（8）：3217-3220.

（编校：吴茜）

Effect of tea polyphenols and sulforaphane on the expression of protein kinase A anchoring protein 95 and cyclin E2 in lung cancer tissue

XUAN Fei1，XU Fang2

（1.Department of Oncology，Laiwu City People's Hospital，Laiwu 271100，China；2.Basic Medical College，Binzhou Medical College，Binzhou 256603，China）

ObjectiveTo investigate the effect of tea polyphenols and sulforaphane on the expression of protein kinase A anchoring protein 95 and cyclin E2 in lung cancer tissue.Methods56 cases confirmed by pathology and operation therapy for lung cancer patients，were randomly divided into combined treatment group and control group，each had 28 cases.The content of protein kinase A anchoring protein 95 and cell cycle protein E2 in all patientswere determined with ELISA.The expression of protein kinase A anchoring protein 95，cyclin E2 and statistics ofmicrovessel density（MVD）were detected by immunohistochemical SPmethod.The protein levels of protein kinase A anchoring protein 95 and cell cycle protein E2 protein were detected by Western Blot.ResultsThe contents of protein kinase A anchoring protein 95 and cyclin E2 in control group were higher than that in combination group，the differences were statistically significant（P＜0.01）.Immunohistochemical SP results showed that protein kinase A anchoring protein 95 and cyclin E2 expression all had positive expression，and the MVD in control group was higher than combination group（P＜0.01）；Western Blot results showed that the expressions of protein kinase A anchoring protein 95 and cyclin E2 protein in control group were higher than combination group（P＜0.01）.ConclusionProtein kinase A anchoring protein 95 and cyclin E2 expressions are increased in both groups in lung cancer tissues，and they are positively correlated，negatively correlated with drug treatment，which can be used as the indexes of lung cancer evaluation.

protein A kinase anchoring protein 95；cyclin E2；lung cancer

R730

A

1005－1678（2014）04－0073－03

肺癌是世界范围内的一种常见的发病率非常高的恶性肿瘤，而且具有非常高的死亡率［1］。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌中最常见的类型，占80%以上。因为没有明显的初期症状及按期的体检，大部分患者都是在晚期时才被确诊，这就导致会出现转移现象，错过了临床上手术治疗的最佳时间。到目前为止在临床治疗非小细胞肺癌的手段主要包括：化疗、放疗、物理治疗、分子靶向治疗等手段［2］。

山东省高校科技计划（J11LF83）

玄菲，女，本科，主治医师，研究方向：肿瘤内科，E-mail：xuanfeilw＠126.com。