吴晓鹏，刘孝民，刘勤，郭艳珍

（河南科技大学第一附属医院肿瘤外科，河南 洛阳 471039）

三氧化二砷联合紫杉醇对A549细胞增殖和裸鼠异位肿瘤生长的影响

吴晓鹏，刘孝民，刘勤，郭艳珍

（河南科技大学第一附属医院肿瘤外科，河南 洛阳 471039）

目的探讨三氧化二砷（As2O3）联合紫杉醇（paclitaxel，PTX）对肺癌的治疗作用。方法噻唑蓝法（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）检测As2O3联合PTX抑制肺癌A549细胞的增殖。采用激光共聚焦显微镜观察给药后对肺癌A549细胞的凋亡诱导作用。通过构建体外肿瘤球模型观察给药后对肿瘤球的生长抑制，模拟给药后药物在体内对肿瘤生长的抑制能力。建立肺癌裸鼠移植瘤模型，随机分为生理盐水组、As2O3干预组、PTX干预组和联合干预组。每天分别用设定浓度的生理盐水、As2O3、PTX、As2O3＋PTX对移植瘤小鼠腹腔内注射给药。观察给药后肿瘤大小的变化，计算抑瘤率。对肿瘤切片分别采用苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）进行染色，考察As2O3、PTX、As2O3＋PTX诱导体内肿瘤细胞凋亡的效果。结果肺癌A549细胞给药48 h后，生理盐水组、As2O3干预组、PTX干预组和联合干预组对肿瘤细胞的抑制率分别为（3.35±0.21）%、（47.55±2.25）%、（64.64±3.35）%和（84.58±3.76）%，各药物干预组与生理盐水组相比，差异的具有统计学意义（P＜0.01）。生理盐水组诱导肿瘤细胞早期凋亡率为0.26%，As2O3干预组为9.7%，PTX干预组为17.8%，联合干预组为42.5%，而与生理盐水组、As2O3干预组和PTX干预组相比，联合干预组能够增加肿瘤细胞早期凋亡率，差异具有统计学意义（P＜0.01）。肿瘤球给药7d后生理盐水组肿瘤球体积增大1.36倍，As2O3干预组、PTX干预组和联合干预组分别使肿瘤体积减小到原体积的（77.35±2.31）%、（61.68±2.44）%和（44.85±3.34）%，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。荷瘤裸鼠治疗实验以生理盐水组为对照，As2O3干预组、PTX干预组和联合干预组对肿瘤生长的抑制率分别为（22.4±4.5）%、（39.5±6.2）%和（69.5±7.3）%，联合干预组与其他组间差异具有统计学意义（P＜0.01）。结论As2O3能够有效增强PTX抑制A549细胞的增殖和裸鼠异位肿瘤的生长，As2O3联合PTX可能作为肺癌潜在有效的治疗手段。

As2O3；紫杉醇；肺肿瘤；联合药物疗法；动物模型

肺癌是全球最普遍发生的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居全球恶性肿瘤之首［1］。近年来，我国肺癌的发病率呈急剧上升趋势。手术、放射治疗和化疗是当前肺癌治疗的主要手段，目前，早中期肺癌的治疗以手术为主，联合化疗为辅。然而，以细胞毒药物为主的化学治疗缺乏选择性，难免产生许多不良反应和毒性，患者耐受性较差。紫杉醇是来源于红豆杉属太平紫杉的一种细胞毒性物质，被广泛用于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、头颈部肿瘤和非小细胞肺癌的治疗［2-3］。三氧化二砷（As2O3）具有诱导肿瘤细胞分化、凋亡及细胞毒等作用，用于治疗急性早幼粒细胞白血病取得了突出的疗效［4］。本研究将紫杉醇与As2O3联合使用，用于肺癌的治疗研究，考察2者联合使用对肺癌的治疗效果，为As2O3应用于肺癌临床治疗提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 胎牛血清购自美国life tech公司；注射用As2O3购自北京双鹭药业；dulbecco's modified eagle medium（DMEM）培养基购自赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司；methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）试剂盒购自 sigma公司；hematoxylin-eosin（HE）试剂盒购自sigma公司；其余试剂为分析纯。A549肺癌细胞购自上海细胞研究所；雄性裸鼠购自成都达硕实验动物公司，动物许可证号：DS2012092。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：将A549细胞置于含有100mg／L胎牛血清的DMEM培养基中培养，培养条件为5%CO2，饱和湿度，温度为37℃。待细胞汇合度为0.8～0.9时，用2.5 mg／L胰酶消化传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 紫杉醇（paclitaxel，PTX）联合As2O3对A549细胞的增殖抑制考察：培养A549细胞并接种于96孔板中，当孔板中细胞完全贴壁且处于对数生长期时分别加入无菌过滤后的生理盐水、As2O3（1mmol／mL）、PTX（10μg／mL）、As2O3＋PTX（As2O3为1mmol／mL，PTX为5μg／mL）。将孔板移入37℃ CO2孵箱中培养24 h和48 h后取出，每孔加入20μL浓度为5mg／mLMTT溶液，再放回孵箱中继续孵育4 h，将孔板中液体倒出，每孔加入200μL二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），37℃避光振摇15min，用酶标仪在490 nm处测定各孔的光密度值（optical density，OD）。

1.2.3 PTX联合As2O3诱导A549细胞的凋亡：为了定性观察不同药物干预诱导细胞凋亡情况，按照“1.2.2”项下给药后于流式细胞仪检测不同药物干预诱导A549细胞凋亡的能力。采用 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）进行细胞核染色。37℃避光30 min，PBS清洗3次，激光共聚焦显微镜观察拍照。

1.2.4 肿瘤球的构建：取对数生长期的A549细胞用0.125%胰酶消化后，用含血清的培养基中和胰酶，并将细胞吹打下来后离心，弃去上清液用培养基重悬细胞后接种于用低熔点琼脂糖预处理的96孔板中，将96孔板移入37℃CO2孵箱中培养。肿瘤球生长7 d后，加入无菌过滤后的As2O3（1 mmol／mL）、PTX（10μg／mL）、As2O3＋PTX（As2O3为 1mmol／mL，PTX为5μg／mL）。以生理盐水为阴性对照组，统计肿瘤球体积大小变化。

1.2.5 肺癌异位瘤模型的构建及紫杉醇联合As2O3对肿瘤的生长抑制考察：A549细胞经胰酶消化，离心后将其悬浮于DMEM培养液中，计数调节浓度至5×107个／mL。取4～6周龄，体质量20～25 g的雄性裸鼠，于本院实验动物中心清洁级实验室内饲养，昼夜照明24 h，相对湿度70%，饲养温度25℃。将准备好的A549细胞悬浊液皮下接种于小鼠背部，每只小鼠接种0.1mL细胞悬浊液。接种后1～2周可见背部长出肿瘤块，证明接种成功。将优选后的24只荷瘤裸鼠随机分成4组，生理盐水组、As2O3干预组（3mg／kg）、PTX干预组（10mg／kg）和 As2O3＋PTX联合干预组（As2O33mg／kg＋PTX 5mg／kg）。各组均采用腹腔注射给药。第21天处死小鼠，剖肿瘤，称重，计算抑瘤率。取肿瘤组织切片。

1.3 统计学方法 采用SPSS 11.0统计软件进行数据分析；计数资料比较采用χ2检验，两两比较采用χ2分割法；正态计量资料用“±s”表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 As2O3增强PTX对A549细胞增殖的抑制作用 MTT实验结果如表1所示，As2O3和PTX均能抑制A549肿瘤细胞的增殖。As2O3和PTX对肿瘤细胞的增殖抑制率随着时间延长而增加，呈现时间依赖性，联合给药组在48 h对肿瘤细胞的增殖抑制率与24 h比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。当As2O3与PTX联合干预时，降低PTX的给药量，对A549细胞的增殖依然能够产生强烈的抑制作用。且联合干预组对肿瘤细胞的抑制能力强于 As2O3干预组和PTX干预组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。肺癌A549细胞给药24 h和48 h后，各给药组与生理盐水组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。

图1 不同药物干预对A549细胞的抑制率Fig.1 The inhibition rate of A549 cells by various drugs after 24 h and 48 h treatments

2.2 As2O3增强紫杉醇诱导A549细胞凋亡 体外研究药物诱导A549细胞凋亡的定量实验结果表明，As2O3干预组、紫杉醇干预组和联合干预组都能不同程度诱导肿瘤细胞的凋亡。As2O3干预组诱导肿瘤细胞早期凋亡率为9.7%，紫杉醇干预组为17.8%，联合干预组为42.5%，而生理盐水组早期凋亡率为0.26%。结果显示，与生理盐水组相比，紫杉醇干预组、As2O3干预组和联合干预组均能诱导肿瘤细胞凋亡，差异具有统计学意义（P＜0.01）。与紫杉醇干预组和As2O3干预组相比，联合干预组能够增加肿瘤细胞凋亡，差异具有统计学意义（P＜0.01，见图2）。A549肿瘤细胞凋亡的共聚焦显微定性实验结果显示，细胞核经DAPI染色后，生理盐水组、紫杉醇干预组和As2O3干预组的细胞核形态均一，呈致密的圆形，无核质核仁释放的迹象，而联合干预组的细胞核明显发生变化，染色质浓缩、核膜破裂、甚至出现凋亡小体（见图3）。

图2 不同药物干预诱导肿瘤细胞凋亡率ΔP＜0.01，与生理盐水组比较；*P＜0.01，As2 O3＋PTX与 As2 O3和紫杉醇单独干预比较Fig.2 The effect of drugs induced cells apoptosisΔP＜0.01，compared with saline group；*P＜0.01，compared with As2 O3 group or paclitaxel group

图3 透射电镜观察不同药物干预诱导A549细胞凋亡形态Fig.3 Cell apoptosis induction and cellmorphology changing of A549 cell by different drugs

2.3 As2O3增强紫杉醇对A549细胞肿瘤球的生长抑制作用 肿瘤球的生长抑制实验结果显示，As2O3和紫杉醇均能抑制肿瘤球的生长。肿瘤球给药7 d后，As2O3干预组、紫杉醇干预组和联合干预组分别使肿瘤体积减小到原体积的（77.35±2.31）%、（61.68±2.44）%和（44.85±3.34）%，生理盐水组肿瘤球体积增大1.36倍，差异具有统计学意义（P＜0.01，见图4）。

图4 给药7 d后肿瘤球体积变化**P＜0.01与生理盐水组相比；ΔP＜0.05，As2 O3＋PTX与As2 O3和紫杉醇相比Fig.4 The change ratio of tumor spheroid after 7 days**P＜0.01，compared with saline group；ΔP＜0.05，compared with As2 O3 group or paclitaxel group

2.4 As2O3增强紫杉醇对肺癌异位瘤的生长抑制作用 荷瘤裸鼠治疗实验以生理盐水组为对照，As2O3干预组、紫杉醇干预组和联合干预组对肿瘤生长的抑制率分别为（22.4±4.5）%、（39.5±6.2）% 和 （69.5±7.3）%，差异有统计学意义（P＜0.01）。联合干预组与其他组间差异具有统计学意义（P＜0.01，见表1）。

表1 不同药物干预对肿瘤生长的抑制率（n＝5）Tab.1 The effect of different drugs inhibiting the growth of tumor（n＝5）

3 讨论

紫杉醇是一种应用广泛的细胞毒性化疗药物，然而随着治疗的进展也出现了一些肿瘤对紫杉醇耐药［5］。As2O3具有诱导肿瘤细胞分化、凋亡及细胞毒等作用，用于治疗急性早幼粒细胞白血病取得了突出的疗效［6］。目前国内外的研究者们对As2O3的抗肿瘤机制进行了广泛而深入的研究，己证实As2O3不仅对血液系统肿瘤有效，其对实体瘤如肺癌、前列腺癌、白血病、胃癌和肝癌的生长和增殖均有抑制作用［7-11］。本研究联合应用As2O3和紫杉醇，考察联合干预对肺癌A549细胞的抑制作用。

本研究考察了As2O3联合紫杉醇对肺癌A549细胞的增殖抑制作用，结果显示，在降低紫杉醇给药量的情况下，As2O3依然能够增强紫杉醇对肺癌细胞的增殖抑制作用，这说明As2O3与紫杉醇联合干预能够产生协同作用。这与刘洪义等将紫杉醇与As2O3联合用于结肠腺癌的研究结果一致［12］。As2O3联合紫杉醇对诱导肺癌细胞凋亡的结果显示与对肺癌细胞的增殖抑制实验结果相一致。在某些实体肿瘤组织中，由于肿瘤组织致密生长，肿瘤内部压力高且血管少，因此抗肿瘤药物很难进入肿瘤组织深部［13-14］。本研究构建了体外肺癌肿瘤球模型用于评价联合给药的抑制肿瘤生长的能力。结果显示，与生理盐水组相比，药物干预能够抑制肿瘤球的生长，联合给药比单独给药更能抑制肿瘤球的生长。荷瘤裸鼠的治疗实验结果显示，当降低紫杉醇给药剂量后其与As2O3联合给药能够达到比常规剂量的紫杉醇化疗更好的抗肺癌疗效，且低剂量联合给药对肿瘤生长的抑制作用显著优于紫杉醇干预组和As2O3干预组。因此，紫杉醇联合As2O3不仅能够高效抑制肺癌的恶性增殖，还能降低化疗药物的用量。

综上，As2O3能够有效增强紫杉醇对肺癌细胞的增殖抑制作用，抑制肿瘤球和肺癌异位肿瘤的生长，是一种潜在的肺癌联合治疗手段。

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（编校：谭玲）

Effect of As2O3and paclitaxel on the proliferation of A549 cell and ectopic tumor grow th of nudem ice

WU Xiao-peng，LIU Xiao-min，LIU Qin，GUO Yan-zhen

（Department of Surgical Oncology，The First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology，Luoyang 471039，China）

ObjectiveTo evaluate the effect of As2O3combined with paclitaxel（PTX）on the treatment of lung cancer.MethodsThe antiproliferation efficiency of As2O3combined with PTX was evaluated by MTT assay.Tumor spheroids were used to evaluate anti-tumor ability of As2O3combined with PTX.Transmission electron microscope（TEM）were used to observe the apoptosis morphous.A549 cell were xenografted in mice to establish the animalmodel，and the nude mices were devided into four groups，saline group，As2O3group，PTX group and As2O3＋PTX group.The animalmodelwere used to evaluate the effectofanti-tumor.The tumor size ofevery group weremeasured.HEwas used to observe the apoptosis of cancer cells.ResultsThe cell inhibition rate of A549 cellwere（3.35±0.21）%，（47.55±2.25）%，（64.64±3.35）%and（84.58±3.76）%after treatment with saline，As2O3，PTX and As2O3combined with PTX after 48h respectively（P＜0.01）.The early apoptosis rate of cancer cellswere0.26%，9.7%，17.8%and 42.5%for saline group，As2O3group，PTX and As2O3＋PTX group respectively（P＜0.01）.The final tumor spheroid volumes in saline group increased 1.36 times after 7 days.The final tumor spheroid volumes reduced to（77.35±2.31）%，（61.68±2.44）%and（44.85±3.34）%in As2O3，PTX and As2O3combined with PTX group respectively（P＜0.01）.The inhibition of lung cancer in vitro demonstrated the inhibition rate of tumor growth compared with saline group were（22.4±4.5）%，（39.5±6.2）%and（69.5±7.3）%for As2O3，PTX and As2O3＋PTX，respectively（P＜0.01）.ConclusionAs2O3combined with PTX can effectively inhibit the proliferation of A549 cellsand ectopic tumor growth in nudemice and itmay be a potentially effective treatment for lung cancer.

As2O3；paclitaxel；lung neoplasm；combination drug therapy；animalmodels

R734.2

A

1005－1678（2014）04－0066－04

吴晓鹏，男，本科，副主任医师，研究方向：肿瘤的生物治疗研究，E-mail：wuxiaopeng147852＠163.com。