何发1,2，王欣1,2，郭佳1,2，李崎2，关锋1,2



ldlD-14细胞表达NCAM并控制其N-聚糖合成的细胞模型的建立

何发，王欣，郭佳，李崎，关锋

1 江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡 214122 2 江南大学生物工程学院，江苏无锡 214122

何发, 王欣, 郭佳, 等. ldlD-14细胞表达NCAM并控制其N-聚糖合成的细胞模型的建立. 生物工程学报, 2014, 30(6): 962−971.He F, Wang X, Guo J, et al.Expression of neural cell adhesion molecule and modification of its N-glycan in ldlD-14 cells. Chin J Biotech, 2014, 30(6): 962−971.

神经细胞黏附分子 (Neural cell adhesion molecule, NCAM) 是一类表达于神经元、胶质细胞、骨骼细胞以及自然杀伤细胞表面的糖蛋白。NCAM在细胞-细胞黏附及神经细胞迁移等过程中起着重要作用，也是用来研究多聚唾液酸(Polysialic acid, PSA)的模式蛋白。将来源于小鼠乳腺上皮细胞NMuMG中的NCAM基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)，转染至中国仓鼠卵巢细胞突变株ldlD-14细胞中，通过抗生素G418筛选及蛋白质印迹法检测，得到过表达NCAM的永久转染细胞株。利用ldlD-14细胞的特性，通过在无血清的基本培养基中添加半乳糖与否可以轻易操纵NCAM分子上糖链的修饰，为后期研究糖基化对NCAM分子功能的影响提供工作基础。

糖链，神经细胞黏附分子，转染，多聚唾液酸，ldlD-14细胞

糖生物学是21世纪生命科学的前沿和热点领域之一，其核心内容是揭示细胞糖链的结构和生物学功能。糖链作为生物信息分子参与细胞生物几乎所有的生命过程，特别是在细胞分化、发育、免疫、老化、癌变、信号传递等生命和疾病过程中起着重要作用。

糖生物学研究的对象之一是发生了糖基化修饰的糖蛋白。糖蛋白上的糖链主要是通过两种糖基化形式形成糖苷键连接于蛋白的特定氨基酸上，分别形成N-聚糖和O-聚糖。N-聚糖是连接在蛋白质肽链中天冬酰胺残基侧链酰胺氮上的寡糖，此类寡糖通常均有一个核心五糖和类似结构的外周糖链。所有的N-聚糖都有一种相同的核心五糖，由3个甘露糖 (Mannose, Man)和2个N-乙酰葡糖胺 (N-acetylglucosamine, GlcNAc) 组成 (图1)。根据核心五糖中2个α-Man上连接的糖链，N-聚糖可分为3类：高甘露糖型 (High-mannose type)、复杂型 (Complex type) 和杂合型 (Hybrid type)。而O-聚糖是指通过N-乙酰半乳糖胺 (N-acetylgalactosamine, GalNAc) 与肽链的丝氨酸或苏氨酸残基相连接形成的聚糖，它不存在共有的核心结构。在 O-聚糖合成时，GalNAc第一个被添加到丝氨酸或苏氨酸残基上，然后其他糖类依次添加上去；但是N-聚糖的合成却不同，它是先合成一个寡糖前体，再整体转移到多肽的天冬酰胺残基上。其中，半乳糖 (Galactose, Gal) 存在于大部分复杂的N-聚糖的分支上，而且也在很多O-聚糖上直接与GalNAc连接。

NCAM属于免疫球蛋白超家族，是一个细胞膜外具有5个Ig型结构域和2个三型纤连蛋白 (Fibronectin type Ⅲ, FN3) 结构域的跨膜糖蛋白，其中5个Ig型结构域上带有6个N-糖基化位点。编码NCAM的mRNA有3种，它们由同一基因的转录产物经不同剪接而成。根据分子量的不同分别命名为NCAM-180、NCAM-140和NCAM-120。连在NCAM上最主要的糖类是唾液酸，主要以PSA链的形式存在于NCAM的第5和第6个N-糖基化位点上。唾液酸以α2-3键连接于Gal β1-4 GlcNAc β1-2/6-核心五糖结构的N-聚糖上，然后在多聚唾液酸转移酶 (Polysialyltransferases) 作用下以α2,8-连接形成含有50–100个唾液酸的线性化多聚物，即PSA。PSA带有诸多负电荷，具亲水性，因此能够形成较大的水合半径。NCAM主要通过胞外的Ig型结构域介导同类分子间结合来调节细胞间的黏附，而PSA的存在使NCAM之间距离过大而失去黏附能力，从而降低了细胞间的黏附作用。由于PSA主要附着在NCAM上，使得NCAM成为研究PSA化作用的模式蛋白。在NCAM分子的3种亚型中，NCAM-140对细胞迁移、肿瘤浸润的作用最明显，本课题组在前期研究中，发现小鼠乳腺上皮细胞 (Normal murine mammary gland epithelial, NMuMG) 在发生上皮间质转化过程 (Epithelial-mesenchymal transition, EMT) 前后，NCAM在mRNA水平以及蛋白水平表达明显上调，其中NCAM-140的蛋白表达量最高且上调幅度最为显著 (数据未发表)，因此本文选用NCAM-140为研究对象。

图1 N-聚糖的结构[3]

本文使用的ldlD细胞是一种中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO) 细胞的突变体，由David M. Kingsley和Monty Krieger筛选得到。由于ldlD细胞存在UDP-Gal/UDP-GalNAc 4-差向异构酶的缺陷，不能利用葡萄糖合成UDP-Gal和UDP-GalNAc，而这两种糖是糖链上Gal和GalNAc的供体，因此导致细胞中不能产生完整的糖链。但是通过外源添加Gal和GalNAc可以完全地纠正该缺陷。正是由于这一缺陷，使得该细胞成为研究糖链生物学功能非常理想的细胞模型，可以通过外源添加Gal或不添加Gal操纵ldlD细胞中蛋白的糖链修饰。利用ldlD细胞这一特性，本实验将NCAM-140的基因稳定转染到该细胞中并表达，用蛋白质印迹法 (Western blotting) 筛选NCAM-140过表达的细胞株，为进一步研究PSA对NCAM-140的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

NMuMG细胞来自于美国模式培养物集存库ATCC。ldlD-14细胞来自于美国华盛顿大学Sen-itiroh Hakomori实验室。大肠杆菌JM109及质粒pcDNA3.1(+)由本室保存。

细胞RNA提取试剂盒和质粒提取试剂盒购于北京康为世纪生物科技有限公司；逆转录试剂盒ReverTra Ace-α-和T4 DNA连接酶购于TOYOBO公司；d Ⅲ和Ⅰ内切酶、1 kb DNA ladder marker、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购于TaKaRa公司；DNA聚合酶和Pro-Light HRP 化学发光检测试剂购于天根生化科技有限公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG抗体购于碧云天生物技术研究所；T-PER组织总蛋白抽提试剂购于美国Thermo公司；DMEM培养基、HAM’S/F-12培养基、胎牛血清和青霉素/链霉素溶液购于Life Technologies公司；Lipofectamine2000转染试剂购于Invitrogen公司；抗生素G418和胰岛素购于美国Sigma公司；NCAM抗体和ITS (Insulin-transferrin-selenium) 购于美国BD公司；GSL-Ⅱ-FITC (Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia lectin Ⅱ, GSL-Ⅱ; Fluorescein isothiocyanate, FITC) 购于美国VECTOR公司；引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物设计和目的基因的扩增

从NMuMG细胞中提取总RNA，在逆转录酶的作用下合成cDNA。根据NCAM-140基因序列 (GenBank Accession No. NM_001081445.1)设计引物，上游引物序列：5′-CCCAAGCTTATGC TGCGAACTAAGGATCT-3′ (引入酶切位点d Ⅲ)，下游引物序列：5′-CCGCTCGAGT CATGCTTTGCTCTCATTCT-3′ (引入酶切位点Ⅰ)。然后以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性 40 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min 30 s，共30个循环；然后72 ℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证后送上海英潍捷基贸易有限公司测序得到确认。

1.2.2 pcDNA3.1(+)/NCAM真核表达载体的构建

扩增得到的NCAM-140基因用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化，然后用d Ⅲ和Ⅰ分别双酶切NCAM-140基因和pcDNA3.1(+)，酶切产物再纯化后在16 ℃下用T4 DNA连接酶连接过夜，然后将连接产物转化到JM109感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB固体平板上37 ℃过夜培养，挑取生长的单菌落提取质粒，经单双酶切及测序鉴定，得到构建成功的重组真核表达载体pcDNA3.1(+)/ NCAM-140。

1.2.3 细胞培养

NMuMG细胞在含10%胎牛血清 (FBS)、10 μg/mL胰岛素、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中生长，ldlD-14细胞在含5% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的HAM’S/F-12培养基中生长；这两种细胞均在37 ℃下含5% CO的细胞培养箱中培养。

ldlD-14细胞在含5% FBS的HAM’S/F-12培养基中培养12 h，然后吸去培养基，加入无血清培养基轻轻清洗一遍，再用添加了ITS (1∶1 000加入)、Gal (20 μmol/L) 和GalNAc (200 μmol/L) 的无血清HAM’S/F-12培养基培养48 h，即可完全修复ldlD-14细胞的糖链缺陷。

1.2.4 细胞转染及阳性单克隆的筛选

将重组质粒pcDNA3.1(+)/NCAM-140和对照质粒pcDNA3.1(+)转染ldlD-14细胞，方法参照Lipofectamine2000的说明书。转染6 h后换含5% FBS的培养基培养24 h，然后以1∶10传代。继续培养24 h后换含250 μg/mL G418的培养基筛选2周。挑取单细胞克隆继续在含 250 μg/mL G418的培养基中扩大培养。然后提取总蛋白用蛋白质印迹法检测，将表达NCAM-140的细胞保存并取少量细胞铺于10 cm的细胞培养皿中，继续培养进行第2次单克隆筛选，以得到过表达NCAM-140的永久转染细胞株。

1.2.5 蛋白质印迹法检测NCAM表达

收集细胞，加入T-PER组织总蛋白抽提试剂，在4 ℃裂解细胞30 min，离心取上清，使用BCA法测定蛋白浓度。样品加入5×蛋白上样缓冲液混合，煮沸5 min，取20 μg蛋白上样进行SDS-PAGE电泳；电泳后，将蛋白转移至 0.45 μm PVDF膜，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h；随后加入一抗 (1∶1 000)，4 ℃孵育12 h，用1×TBST洗5次；加辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的二抗 (1∶5 000)，室温作用1 h，用1×TBST洗5次，然后用Pro-Light HRP化学发光检测试剂显色，用Bio-Rad ChemiDoc™ XRS+系统扫描成像。

1.2.6 蛋白质印迹法检测糖链修饰后的NCAM

在6孔板中每孔接种2×10个细胞，用含5% FBS的HAM’S/F-12培养基培养24 h，吸去培养基后用无血清培养基冲洗一遍；然后分别加入含有5% FBS、ITS、ITS+Gal (5 μmol/L，10 μmol/L或20 μmol/L)+GalNAc (200 μmol/L) 的培养基培养48 h (ITS以1∶1 000加入，以下实验相同)，用上述方法提取蛋白，测蛋白浓度，最后用蛋白质印迹法检测。

1.2.7 凝集素细胞染色

在24孔板中放入圆形盖玻片，用胰酶消化细胞制成细胞悬液，每孔加入0.5 mL含5% FBS的培养基，细胞量为2×10个。培养24 h后换液，分别用含有5% FBS、ITS、ITS+Gal和ITS+Gal+GalNAc的培养基继续培养24 h。然后吸出培养基，用1×PBS洗2遍，4% 多聚甲醛固定15 min；用1×PBS洗3遍，加入0.1% Triton X-100溶液通透化细胞10 min；再用1×PBS洗3遍，1% BSA溶液4 ℃封闭过夜。然后用浓度为0.7 μg/mL GSL-II-FITC/PBS室温下避光孵育3 h，1×PBS洗3遍，Hoechst 33342染色10 min，最后将细胞爬片倒扣在滴有Glycergel固封剂的载玻片上，晾干后于4 ℃条件下避光保存。用尼康倒置荧光显微镜eclipse ti-U在10×60倍下观察。

1.2.8 流式细胞检测

在12孔板中加入细胞，每孔细胞量为1×10个，在5% FBS的培养基中培养12 h。分别用含有5% FBS、ITS、ITS+Gal (5 μmol/L，10 μmol/L或20 μmol/L)+GalNAc (200 μmol/L) 的培养基继续培养48 h。然后用胰酶消化3 min，细胞悬液转移到离心管中，加入1×PBS洗2遍，2 000 r/min、4 ℃离心5 min收集细胞；用1 mL预冷的1×PBS重悬细胞，加入1 μg GSL-II-FITC混匀，冰上孵育30 min，然后2 000 r/min、4 ℃离心，用PBS洗去多余的凝集素。用1 mL预冷的1×PBS重悬细胞，转移到流式细胞管中。用美国BD公司生产的流式细胞仪FACSCalibur分析细胞的荧光强度。

2 结果与分析

2.1 目的基因的扩增及重组载体的酶切验证

以NMuMG细胞的cDNA为模板，使用上述引物在高保真DNA聚合酶的作用下进行PCR扩增，所得NCAM-140基因片段大小为2 547 bp。将NCAM-140基因插入到pcDNA3.1(+)质粒中，构建成pcDNA3.1(+)/ NCAM-140真核表达载体。转化JM109感受态，筛选到的转化子再提质粒进行单、双酶切验证 (图2)。如图2所示，重组质粒经过单酶切 (泳道3) 和双酶切 (泳道2) 后均出现理论上大小的DNA片段。另外，基因测序结果也与GeneBank中的NCAM-140序列完全一致，表明pcDNA3.1(+)/NCAM-140真核表达载体构建成功。

图2 重组表达载体pcDNA3.1(+)/NCAM-140的酶切验证

2.2 蛋白质印迹法检测NCAM的表达及在不同处理下糖链的连接情况

将pcDNA3.1(+)/NCAM-140重组载体转染到ldlD-14细胞，得到15株单克隆细胞，提取这15株细胞及转染对照质粒pcDNA3.1(+) 细胞的蛋白进行Western blotting检测，经验证最终得到6株过表达NCAM-140的细胞株。如图3A所示，转染重组载体并过表达NCAM-140的细胞在 140 kDa处检测到目的条带，而泳道7的对照组未检测到很明显的条带。说明转染的NCAM-140基因在ldlD-14细胞中得到稳定地表达，建立了小鼠NCAM-140基因稳定转染的细胞株。

将该ldlD-14/NCAM-140细胞在分别含有5% FBS、ITS、ITS+GalNAc+Gal (5 μmol/L、 10 μmol/L或20 μmol/L) 的培养基中培养，用Western blotting检测NCAM-140的表达及分子量大小。从图3B中可知NCAM-140的分子量大小具有明显的区别。在只添加ITS时，培养基中没有合成糖链所必需的Gal和GalNAc，NCAM-140上只被有缺陷的短糖链修饰，分子量最小。当添加不同浓度的Gal时，细胞合成糖链的缺陷逐渐被纠正。在含5% FBS的培养基中培养时，细胞也能合成少量完整的糖链，这是由于FBS含有少量的Gal所致。而当Gal的浓度增加到20 μmol/L时，NCAM-140的泳动速率最慢，表示NCAM上合成有较为完整的糖链。

图3 Western blotting检测ldlD-14中NCAM-140的表达

2.3 凝集素检测稳定转染细胞株的糖链完整性

凝集素GSL-Ⅱ能专一性地识别寡糖链非还原末端上以α-或β-连接的GlcNAc。由于N-聚糖除高甘露糖型外，连接五糖核心的结构大部分为Gal β1-4 GlcNAc结构。ldlD细胞存在UDP-Gal和UDP-GalNAc 4-差向异构酶的缺陷，使细胞在只含有葡萄糖的培养基中不能合成UDP-Gal和UDP-GalNAc，最终导致细胞合成的N-聚糖不完整，其末端多以GlcNAc结束。而在基本培养基中添加Gal和GalNAc后，细胞可以通过补救途径合成UDP-Gal和UDP-GalNAc，进而产生完整的N-聚糖。如图4A所示，在含ITS的无血清培养基中，ldlD/NCAM-140细胞合成的N-聚糖末端暴露出更多的GlcNAc，因此对GSL-II-FITC的结合最强，也产生最强的荧光信号。因此在含有5% FBS的培养基中，ldlD/NCAM-140细胞合成的N-聚糖末端的GlcNAc有小部分被血清中含有的少量Gal进一步修饰，导致荧光信号略微减弱。而在含有足够的Gal或GalNAc的无血清培养基中，过量的Gal中和了N-聚糖末端的GlcNAc，保证了ldlD/NCAM-140细胞合成N-聚糖的完整性，该条件下GSL-II-FITC的结合能力最弱，其荧光信号也相应最弱。由于NCAM主要被N-聚糖修饰，而GalNAc在此过程中几乎没有参与，因此GalNAc对GSL-II-FITC结合细胞产生的荧光信号没有影响。

为进一步验证上述结果，用流式细胞术检测了在不同浓度的Gal培养条件下，ldlD/NCAM-140细胞对GSL-II-FITC的结合能力。如图4B所示，当细胞培养在含ITS的无血清的培养基中，细胞N-聚糖末端多为GlcNAc，荧光信号最强。添加5% FBS或者逐渐提高Gal的浓度，ldlD/NCAM-140细胞N-聚糖进一步发生修饰，导致GSL-II结合能力减弱，因此在流式细胞实验结果中表现出荧光信号逐渐减弱，该结果与荧光显微细胞照相的结果完全一致。

3 讨论

蛋白质、核酸和糖是构成生命的三类大分子，由于糖链的结构非常复杂，不像核酸和蛋白质具有通用的模板，而且糖链结构测定及糖链合成等关键技术还不成熟，导致对糖链的研究远远落后于对蛋白质和核酸的研究，糖链对生命的影响仍然存在太多的奥秘亟待探索和研究。随着生命科学的发展，糖生物学越来越被人们所重视，已然成为21世纪生命科学新的研究热点领域。其中，糖蛋白作为最普遍也是最重要的糖缀合物，已成为研究糖链结构与功能的重要实验对象，其中的NCAM是一个用来研究糖链尤其是PSA链合成及功能的模式糖蛋白。因此，本研究选择NCAM-140为研究对象，通过转染使其在糖链合成存在缺陷的ldlD-14细胞中稳定过表达，可以人为地控制NCAM上糖链的修饰，为后续研究NCAM上糖链对其蛋白功能的行使提供细胞模型。

图4 ldlD-14细胞的凝集素GSL-II-FITC染色

本研究从小鼠胸腺上皮细胞中克隆NCAM-140基因，构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/NCAM-140。将该重组载体转染ldlD-14细胞，成功筛选到过表达NCAM-140的单克隆转染细胞株，用Western blotting检测验证了NCAM-140的表达 (图3A)。通过对ldlD-14/NCAM-140细胞进行凝集素染色显示，该细胞在含有Gal和GalNAc的培养基中培养后，ldlD-14细胞中有缺陷的糖链能完全被修复 (图4A和4B)。此外，如图3B所示，分别在含有5% FBS、ITS、ITS+Gal和ITS+Gal+GalNAc的培养条件下分别对NCAM-140分子量大小的检测结果也间接说明：可以利用ldlD-14细胞的特点调控NCAM分子上N-聚糖的延长，最终实现对NCAM多聚唾液酸化的控制，为后续对PSA的研究提供理想的细胞模型。

PSA主要附着在NCAM分子上，PSA在胚胎发育时期表达量较高，在成人组织中表达较少，而且其表达也局限于脑部神经组织，但在某些特定脑区如嗅球和海马，PSA的表达水平仍然很高。NCAM上的PSA对神经细胞迁移、轴突生长、生物节律的控制、神经可塑性记忆的形成都有一定影响，而且在嗅球形成中也起重要作用。表达无唾液酸修饰NCAM的小鼠表现出神经轴突生长减弱，免疫力低下，甚至无法发育生长，说明了PSA在大脑发育中的重要作用。此外，在一些恶性肿瘤组织中，如成神经细胞瘤、肾母细胞瘤等也发现了PSA的高表达，高表达的PSA可以显著促进癌细胞的分离、浸润和转移。

近来，Lehembre等发现NMuMG和MCF 7细胞在发生EMT时，NCAM的表达显著上升，其亚细胞定位改变，并与P59结合后激活了FAK激酶介导的信号通路，而阻碍了FGFs介导的PLCγ/PKCα和Ras/Raf/MAPK信号通路，提高细胞的侵袭与迁移能力。EMT是肿瘤细胞恶性增殖及转移的重要过程，而NCAM以及NCAM上的PSA链都与癌细胞的侵润和转移相关，因此研究NCAM上的PSA以及PSA对NCAM功能的影响，将有助于深入了解PSA及NCAM在癌症发生及转移中的作用。由于PSA是与N-聚糖末端的Gal形成糖苷键而连接在NCAM上的，所以，本研究构建的ldlD-14/NCAM-140细胞模型，可以通过在基本培养基中调节Gal浓度的大小以方便地操纵NCAM上PSA链的合成，该实验模型为进一步研究PSA的修饰以及PSA链的长短对NCAM介导的细胞粘附及相关信号通路影响的研究提供了良好的基础。

REFERENCES

[1] Jin C. Glycobiology-essential for discovery of gene’s function. J Grad School Chin Acad Sci, 2001, 18(1): 66–75 (in Chinese).金城. 糖生物学——破解基因组功能的必由之路. 中国科学院研究生院学报, 2001, 18(1): 66–75.

[2] Kingsley DM, Kozarsky KF, Hobbie L, et al. Reversible defects in O-linked glycosylation and LDL receptor expression in a UDP-Gal/UDP- GalNAc 4-epimerase deficient mutant. Cell, 1986, 44: 749–759.

[3] 燕秋. 第三章糖复合物[EB/OL]. [2014-01-25]. http://61.187.179.69/ec2006/C26/Course/Content/N85/200505111617.htm.

[4] Hildebrandt H, Mühlenhoff M, Gerardy-Schahn R. Polysialylation of NCAM. Adv Exp Med Biol, 2010, 663: 95–109.

[5] Li J, Dai G, Cheng YB, et al. Polysialylation promotes NCAM-mediated cell migration in an FGFR-dependent manner, but independent of adhesion capability. Glycobiology, 2011, 21(8): 1010–1018.

[6] Geyer H, Bahr U, Liedtke S, et al. Core structures of polysialylated glycans present in neural cell adhesion molecule from newborn mouse brain. Eur J Biochem, 2001, 268(24): 6587–6599.

[7] von der Ohe M, Wheeler SF, Wuhrer M, et al. Localization and characterization of polysialic acid-containing N-linked glycans from bovine NCAM. Glycobiology, 2002, 12(1): 47–63.

[8] Kleene R, Schachner M. Glycans and neural cell interactions. Nat Rev Neurosci, 2004, 5(3): 195–208.

[9] Gascon E, Vutskits L, Kiss JZ. Polysialic acid- neural cell adhesion molecule in brain plasticity: from synapses to integration of new neurons. Brain Res Rev, 2007, 56(1): 101–118.

[10] Kiss JZ, Rougon G. Cell biology of polysialic acid. Curr Opin Neurobiol, 1997, 7(5): 640–646.

[11] Yang P, Major D, Rutishauser U. Role of charge and hydration in effects of polysialic acid on molecular interactions on and between cell membranes. J Biol Chem, 1994, 269(37): 23039–23044.

[12] Johnson CP, Fujimoto I, Rutishauser U, et al. Direct evidence that neural cell adhesion molecule (NCAM) polysialylation increases intermembrane repulsion and abrogates adhesion. J Biol Chem, 2005, 280(1): 137–145.

[13] Fujimoto I, Bruses JL, Rutishauser U. Regulation of cell adhesion by polysialic acid: effects on cadherin, immunoglobulin cell adhesion molecule, and integrin function and independence from neural cell adhesion molecule binding or signaling activity. J Biol Chem, 2001, 276(34): 31745–31751.

[14] Prag S, Lepekhin EA, Kolkova K, et al. NCAM regulates cell motility. J Cell Sci, 2002, 115: 283–292.

[15] Lehembre F, Yilmaz M, Wicki A, et al. NCAM-induced focal adhesion assembly: a functional switch upon loss of E-cadherin. EMBO J, 2008, 27: 2603–2615.

[16] Kingsley DM, Krieger M. Receptor-mediated endocytosisof low density lipoprotein: somatic cell mutants define multiplegenes required for expression of surface receptor activity. Proc Natl Acad Sci USA, 1984, 81(17): 5454–5458.

[17] Ono M, Handa K, Withers DA, et al. Motility inhibition and apoptosis are induced by metastasis-suppressing gene product CD82 and its analogue CD9, with concurrent glycosylation. Cancer Res, 1999, 59: 2335–2339.

[18] Jin C. Glycobiology: the extension of genomics and proteomics. World Sci-tech R & D, 2001, 23(2): 31–34 (in Chinese).金城. 糖生物学: 基因组学和蛋白质组学的延伸. 世界科技研究与发展, 2001, 23(2): 31–34.

[19] Seki T, Arai Y. Distribution and possible roles of the highly polysialylated neural cell adhesion molecule (NCAM-H) in the developing and adult central nervous system. Neurosci Res, 1993, 17(4): 265–290.

[20] Theodosis DT, Rougon G, Poulain DA. Retention of embryonic features by an adult neuronal system capable of plasticity: polysialylated neural cell adhesion molecule in the hypothalamo- neurohypophysial system. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88(13): 5494–5498.

[21] Brusés JL, Rutishauser U. Roles, regulation, and mechanism of polysialic acid function during neural development. Biochimie, 2001, 83(7): 635–643.

[22] Stummeyer K, Dickmanns A, Mühlenhoff M, et al. Crystal structure of the polysialic acid-degrading endosialidase of bacteriophage K1F. Nat Struct Mol Biol, 2005, 12(1): 90–96.

[23] Yamamoto N, Inui K, Matsuyama Y, et al. Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons. J Neurosci, 2000, 20(24): 9145–9151.

[24] Weinhold B, Seidenfaden R, Röckle I, et al. Genetic ablation of polysialic acid causes severe neurodevelopmental defects rescued by deletion of the neural cell adhesion molecule. J Biol Chem, 2005, 280(52): 42971–42977.

[25] Angata K, Huckaby V, Ranscht B, et al. Polysialic acid-directed migration and differentiation of neural precursors are essential for mouse brain development. Mol Cell Biol, 2007, 27(19): 6659–6668.

[26] Câmara J, Jarai G. Epithelial-mesenchymal transition in primary human bronchial epithelial cells is Smad-dependent and enhanced by fibronectin and TNF-alpha. Fibrogenesis & Tissue Repair, 2010, 3: 2.

(本文责编 郝丽芳)

Expression of neural cell adhesion molecule and modification of its N-glycan in ldlD-14 cells

Fa He, Xin Wang, Jia Guo, Qi Li, and Feng Guan

1 Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry & Biotechnology Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 2 School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

Neural cell adhesion molecule (NCAM) is a glycoprotein expressing on the surface of neurons, glial cells, bone cells and natural killer cells. NCAM plays an important role in the process of cell - cell adhesion and cell migration, and is also a model protein to study polysialic acid. In this paper, NCAM gene from mouse mammary gland cells (NMuMG) was cloned into eukaryotic expression vectors pcDNA3.1(+) and transfected into mutant Chinese hamster ovary cells ldlD-14. The stable transfection over-expressing NCAM was obtained through the G418 selection and confirmed by Western blotting. Due to unique characters of ldlD-14 cells, carbohydrate chain of NCAM molecule can be easily manipulated with or without adding galactose in the serum free medium, and this modification can provide the basis for further studies on the effect of glycosylation on NCAM molecular function.

carbohydrate chain, neural cell adhesion molecule, transfection, polysialic acid, ldlD-14 cell

September 13, 2013; Accepted:February 10, 2014

National Natural Science Foundation of China (No. 81201572).

Qi Li. Tel:+86-510-85918176; E-mail: liqi@jiangnan.edu.cn Feng Guan. Tel: +86-510-85918126; E-mail: fengguan@jiangnan.edu.cn

国家自然科学基金(No. 81201572) 资助。

网络出版时间：2014-03-10

http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.130478.html